秦谷雨，楊 勇，李 郁，魏建忠，孫 裴，＊

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥230036；2.安徽安泰農(nóng)業(yè)集團，安徽合肥230036）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、輪狀病毒（Rotavirus，RV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudotabie，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus-2，PCV-2）的單獨或混合感染是引起仔豬病毒性腹瀉的重要病因［1-3］。各種年齡的豬均對這5種病毒易感，尤其是哺乳仔豬感染率與病死率都很高［4-5］。2010年冬季以來，新生仔豬病毒性腹瀉在我國乃至東南亞多個養(yǎng)豬國家呈現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率的流行態(tài)勢，死亡仔豬超過100萬頭，造成巨大的經(jīng)濟損失［8-9］。目前，我國南方數(shù)?。◤V西、廣東、福建、甘肅等?。ζ洳∫虻难芯勘砻鳎≡饕荘EDV的變異株，與韓國2011年流行株的同源性最高［5-7］。但是不同地區(qū)有其相應區(qū)域性，尚未有研究在安徽省地區(qū)造成仔豬病毒性腹瀉的病因。本試驗旨在探索出安徽省致使仔豬腹瀉流行的病毒性病因，為制定適宜安徽省防控仔豬腹瀉的措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2011年10月～2012年5月，從安徽地區(qū)37個規(guī)模化豬場采集腹瀉仔豬的糞便或病死豬腸段共計186份（表1），仔豬日齡范圍為1日齡～60日齡，其中1日齡～10日齡仔豬120例，11日齡～15日齡仔豬35例，30日齡～60日齡仔豬31例；病料在-80℃保存。PEDV、TGEV、PDV陽性病料由華中農(nóng)業(yè)大學何啟蓋教授惠贈，PRV和PCV-2陽性毒株由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病實驗室分離、鑒定與保存。

1.1.2 主要試劑 RNAsimple Total RNA kit為OMEGA公司產(chǎn)品；Quant One Step RT-PCR Kit為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；RNA反轉錄酶、RNA 酶抑制劑、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL 600等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 參考文獻［2，11］以及根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的PEDV、TGEV、PDV、PRV、和PCV-2核酸序列進行引物設計，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。P1／P2為PEDV檢測引物，擴增片段大小為213bp；P3／P4為TGEV檢測引物，擴增片段大小為546bp；P5／P6為PDV檢測引物，擴增片段大小為309bp；P7／P8為PRV檢測引物，擴增片段大小為217bp；P9／P10為PRV-2檢測引物，擴增片段大小為630bp（表2）。1.2.2 病料處理 按照文獻［12］，取2cm～3cm的腸段或5g仔豬腹瀉糞便，用滅菌的玻璃勻漿器進行研磨，用pH7.4的Hanks液做10倍稀釋，反復凍融2次～3次，3 000r／min離心10min；取上清液；4℃、12 000r／min離心5min；收集上清液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 187份病料來源Table 1 Sources of collected 187diseased materials

表2 5種病毒PCR及RT-PCR特異性檢測引物序列及擴增片段大小Table 2 Sequences and sizes of used for PCR（RT-PCR）amplification of 5kinds of viruses

1.2.3 DNA的提取及PRV／PCV-2的檢測 取250μL上述病料上清液加400μL消化液，55℃水浴，消化4h～5h；12 000r／min離心10min；取400 μL上清液，加200μL Tris飽和酚，200μL氯仿，翻轉均勻，12 000r／min離心10min，取上清400μL，加800μL冰凍乙醇，置-20℃沉淀30min，12 000 r／min離心5min，4℃，棄液，再加500μL 700 mL／L乙醇洗滌，棄去干燥，加ddH2O 30μL～50 μL溶解，置-20℃保存?zhèn)溆?。PRV的PCR擴增條件為：PCR反應體系為25μL，含有Gc-mix 12.5μL（TaqE＋dNTP），去離子水5.5μL，上引物 P5 1μL，下引物P6 1μL，DNA模板5μL。PCR反應條件為：94℃3min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，40個循環(huán)；72℃7min。設PRV細胞毒作為陽性對照，PRV陰性病料作為陰性對照。PCV-2的PCR擴增條件為：根據(jù)參考文獻［13-14］進行PCR操作，PCR反應體系為25μL，其中DNA模板（1pmol／μL）5μL，Mix（TaqE＋dNTP）13μL，去離子水5μL，上引物P9 1μL，下引物P10 1μL；PCR反應條件為：95℃10min；95℃1min，72℃40s，49℃50s，35個循環(huán)；72℃10min。設PCV-2細胞毒作為陽性對照，PCV-2陰性病料作為陰性對照。1.2.4 RNA的提取及PEDV、TGEV和PDV的檢測 按照RNA Simple Total RNA Kit試劑盒說明書提取病料總RNA。按照Quant One Step RTPCR Kit說明書，分別進行PEDV、TGEV和PDV的檢測。Quant One Step RT-PCR反應體系與操作方法為：反應總體系50μL，冰上操作，預加入30.5μL的Quant One Step RT-PCR反應混合液，再加入1μg～10ng總RNA模版，分別加上、下游引物（濃度為10μmol／L）各3μL，補 RNase-free ddH2O至50μL。根據(jù)參考文獻［11-12］，PEDV、TGEV的PCR反應條件為：95℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min；PDV的PCR反應條件為：94℃4min；94℃45s，50℃45 s，72℃ 45s，30個循環(huán)；72℃ 7min。設 PEDV、TGEV和PDV細胞毒作為陽性對照，未接毒細胞作為陰性對照。

2 結果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物

瓊脂糖凝膠電泳顯示，5種病毒陽性病料PCR擴增產(chǎn)物大小與預期片段大小一致，如PEDV陽性病料擴增到大小為213bp的片段；TGEV陽性病料擴增到大小為546bp的片段；PDV陽性病料擴增到大小為309bp的片段；PRV陽性病料擴增到大小為217bp的片段；PRV-2陽性病料擴增到大小為630bp片段。5種病毒陰性對照均未擴增到目的片段（圖1）。結果表明，所設計的引物能作為相應病毒的檢測。

圖1 5種病毒PCR檢測結果Fig.1 PCR results of five viruses

2.2 病料中5種病原檢測結果

對186份病料進行5種病原PCR檢測結果顯示，PEDV陽性病料數(shù)為110例（占59.1%），陽性豬場28個（占75.7%）；TGEV陽性病料數(shù)為10例（占5.4%），陽性豬場3個（占8.1%）；RV陽性病料數(shù)為5例（占2.7%），陽性豬場1個（占2.7%）；PRV陽性病料數(shù)為15例（占8.1%），陽性豬場8個（占21.6%）；PCV-2陽性病料數(shù)為48例（占25.8%），陽性豬場20個（占54.1%）。

PEDV與TGEV混合感染陽性病料數(shù)為8例（占4.3%），PEDV與PCV-2混合感染陽性病料數(shù)為35例（占18.8%），PEDV與PRV混合感染陽性病料數(shù)為20例（占10.8%），PRV和PCV-2陽性病料數(shù)為9例（占4.8%），其他病因50例（占26.9%）。

安徽地區(qū)2011年10月～2012年5月期間37個規(guī)?；i場仔豬病毒性腹瀉病原中，PEDV感染率最高，陽性率可達59.1%，是導致仔豬腹瀉的主要病因；其次PCV-2和或PRV單一感染和或PEDV的混合感染，也是造成該地區(qū)仔豬腹瀉的重 要原因。

圖2 5種病毒單一或混合感染率Fig.2 Single or mixed infection rates of five viruses

3 討論

2011年何啟蓋［15］報道了華中地區(qū)57個豬場的855份樣品的檢測結果顯示，其中33個豬場為PEDV感染，陽性場占58%，PCV-2陽性場占46%，RV陽性場占22%，TGEV陽性場占14%。本研究結果顯示，PEDV陽性豬場占75.7%，PCV-2陽性豬場占54.1%，PEDV與PCV-2混合感染陽性占18.8%、PEDV與PRV混合感染陽性數(shù)占10.8%，結果表明安徽地區(qū)PEDV的感染是近2年仔豬腹瀉的重要傳染性病因。PCV-2、PRV和或PEDV單一或混合感染也是豬群腹瀉的重要病因。

比較已有報道［1，8，10，12］，本研究結果提示，安徽省豬流行性腹瀉的流行病學發(fā)生了新特點：①流行范圍廣，幾乎遍布了安徽省各個地區(qū)。②免疫接種豬仍發(fā)病。本文受檢37個豬場中有50%以上每年9月份免疫減毒或滅活腹瀉三聯(lián)苗（PEDV＋TGEV＋RV）或二聯(lián)苗（PEDV＋TGEV），然而腹瀉疫情仍有發(fā)生。③季節(jié)性變得不明顯。不僅在冬季流行情況嚴重，時間上也一直蔓延到了今年的春末（4月和5月份仍有發(fā)生）。有報道［16］其他省區(qū)夏季高溫時期仍有出現(xiàn)流行性腹瀉。④高發(fā)于哺乳仔豬。187份病料中，1日齡～10日齡仔豬120例，11日齡～15日齡仔豬35例，30日齡～60日齡仔豬31例，哺乳仔豬發(fā)病數(shù)占82.9%，癥狀也最嚴重?；疾∽胸i表現(xiàn)水樣腹瀉，或伴隨嘔吐，嘔吐多發(fā)生于吃食或吮乳之后。糞便如水，呈灰黃色或灰色［17-18］。仔豬消瘦，皮膚呈油膩狀，常于腹瀉后2d～4d內因脫水而死亡，病死率最高達100%。

綜合研究結果，PEDV、PCV-2、PRV的單純或混合性感染是近年安徽省仔豬腹瀉的最為重要的三大病毒性疾病，結果提示在今后的豬腹瀉病防控過程中應該著重加強該3種疾病的綜合防控，同時本研究所設計的5種病原PCR引物也為該5種病原的快速診斷提供了技術基礎。

［1］ 楊漢春.2010年豬病流行情況與2011年流行趨勢及防控對策［J］.豬業(yè)科學，2011（1）：47-48.

［2］ 田小燕，孫 華，鄧雨修，等.3種致豬腹瀉病毒的多重RTPCR檢測［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（9）：54-57.

［3］ Allan G M，Meehan B，Todd D，et al.Novel porcine circo viruses from pigs with wasting disease syndrones［J］.Vet Rec，1998，142（7）：467-468.

［4］ Chae C，Kim O，Choi C，et al.Prevalence of porcine epidemic diarrhea virus and transmissible gastroenteritis virus infection in Korean pigs［J］.Vet Rec，2000，147：606-608.

［5］ Sabrina W，Peter T，Witkowski B A，et al.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in sucking piglets.China［J］.Emerging Infect Dis，2012，1：161-163.

［6］ Daesub S，Bongkyun P.Porcine epidemic diarrhoea virus：a comprehensive review of molecular epidemiology，diagnosis，and vaccines［J］.Virus Genes，2012，44：167-175.

［7］ Isao S，Tomoyuki T，Masahumi M，et al.Isolation of porcine epidemic diarrhea virus in porcine cell cultures and experimental infection of pigs pf different ages［J］.Vet Microbiol，2000，72，173-182.

［8］ 黃建龍，劉道新.豬流行性腹瀉流行形式和綜合防控措施［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（2）：88.

［9］ 王隆柏，吳學敏，車勇良.豬流行性腹瀉病毒ORF3和 M基因的克隆與序列分析［J］.中國動物傳染病學報，2012，20（3），67-72.

［10］ 劉孝珍，陳建飛.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2012（3）：180.

［11］ 劉 鄧，袁秀芳，徐麗華，等.豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒雙重RT-PCR鑒別方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（10）：1-5.

［12］ 陳 強，曾麗莉，俞伏松，等.規(guī)?；i場仔豬腹瀉4種病原的感染情況調查［J］.福建農(nóng)業(yè)學報，2010（1）：8-10.

［13］ 孫 裴，李 郁，魏建忠，等.安徽省豬呼吸道疾病五種病原的分離與鑒定［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（12）：56-59.

［14］ 李 郁，楊世興，魏建忠，等.安徽省部分豬場豬圓環(huán)病毒2型感染情況調查 ［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2007（29）：732-734.

［15］ 何啟蓋.豬腹瀉病的鑒別診斷與防控措施［J］.豬病防制，2011（12）：22-24.

［16］ 張世忠，江 斌.2011年福建省豬流行性腹瀉的流行特點及其防治措施［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2012（2）：23.

［17］ 潘明興.都勻地區(qū)豬流行性腹瀉的調查與診治［J］.動物醫(yī)學進，2008，29（S1）：101-102.

［18］ 孫俊峰，柳立新.豬流行性腹瀉的診療體會［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2012（2）：124-125.