胡 輝，荊緒斌，蔡先彬，王欽加

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科，廣東 汕頭 515041）

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的一種酚類色素，其抗腫瘤效應(yīng)近年來受到關(guān)注，有實(shí)驗證實(shí)姜黃素有確切的抗腫瘤活性［1－4］。作者的前期研究證實(shí)了姜黃素能夠誘導(dǎo)肝癌SMMC－7721細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。本研究旨在探討加入過氧化氫酶前、后姜黃素誘導(dǎo)肝癌SMMC－7721細(xì)胞凋亡的變化，以初步闡述姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 姜黃素（C21H20O6）購于成都思科華公司，純度大于98%，過氧化氫酶（CAT）、二甲基亞楓（DMSO）購自Sigma公司，碘化丙啶（PI）、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，胰蛋白酶（Tyrisin）購自Promega公司，2、7－二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH－DA）和碘化二已基惡碳菁（DIOC6）分子探針購自美國Ciochem公司。將姜黃素溶于DMSO中，使用時用培養(yǎng)基配成8mmol／L。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌SMMC－7721細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%的胎牛血清、100U／mL青霉素和100mg／L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，每周傳代2次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。人肝癌SMMC－7721細(xì)胞為汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理室饋贈。

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)過氧化氫（H2O2）測定 DCFH－DA和細(xì)胞內(nèi)H2O2結(jié)合能發(fā)出熒光，常用于檢測H2O2水平。將細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，生長至90%融合時，對照組加入等量培養(yǎng)基，實(shí)驗組加入80μmol／L姜黃素，分別作用1、2、3h，胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度。在檢測30min前加入終濃度為5μmo／L的DCFH－DA，檢測細(xì)胞數(shù)為1×106個，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為530 nm。

1.2.3 線粒體膜電位檢測 DIOC6是線粒體的特異熒光染料，廣泛用于線粒體膜電位的檢測。將細(xì)胞接種在6孔培養(yǎng)板中，生長至90%融合時，對照組加入等量培養(yǎng)基，實(shí)驗組加入80μmol／L姜黃素，預(yù)處理組在實(shí)驗組基礎(chǔ)上加入100μg／mL CAT，分別作用6、12h，胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度。DIOC6終濃度為100μmol／L，檢測細(xì)胞數(shù)為1×106個，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為530nm。

1.2.4 細(xì)胞亞二倍體凋亡峰測定 將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，生長至90%融合時，對照組加入等量培養(yǎng)基，實(shí)驗組加入80μmol／L姜黃素，預(yù)處理組在實(shí)驗組基礎(chǔ)上加入100μg／mL CAT，分別作用24、48h，胰蛋白酶消化，PBS洗2次，70%乙醇固定，4℃過夜，PBS洗3次，0.5mg／mL RNA酶37℃作用1 h，用50μg／mL的PI染色，在4℃避光培養(yǎng)30min，300目尼龍網(wǎng)過濾后流式細(xì)胞儀檢測，檢測細(xì)胞數(shù)為1×106個。激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為620nm。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞內(nèi)H2O2姜黃素作用細(xì)胞后短時間內(nèi)即產(chǎn)生H2O2，隨著時間延長，H2O2生成增加。在1、2、3h時間點(diǎn)，熒光強(qiáng)度分別為（13.49±3.23）%、（52.43±6.04）%、（48.21±7.18）%，除2h時間點(diǎn)和3h時間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）外，余兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明在2h左右 H2O2產(chǎn)生達(dá)高峰，見圖1。

圖1 不同時間點(diǎn)過氧化氫變化

2.2 線粒體膜電位 細(xì)胞在姜黃素作用后，線粒體膜電位發(fā)生變化。以對照組為參照100%，6h時間點(diǎn)實(shí)驗組和預(yù)處理組熒光強(qiáng)度分別為（59.68±4.47）%、（73.33±3.68）%；差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝32.19，P＜0.01）；12h時間點(diǎn)實(shí)驗組和預(yù)處理組熒光強(qiáng)度分別為（29.83±6.22）%、（46.98±6.32）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝28.45，P＜0.01），說明CAT能部分抑制線粒體膜電位降低，見圖2、3。

圖2 6h線粒體膜電位變化

圖3 12h線粒體膜電位變化

圖4 24h細(xì)胞亞二倍體凋亡峰變化

圖5 48h細(xì)胞亞二倍體凋亡峰變化

2.3 亞二倍體凋亡峰 姜黃素作用細(xì)胞后發(fā)生凋亡。在24h時間點(diǎn)對照組、預(yù)處理組、實(shí)驗組熒光強(qiáng)度分別為（3.11±0.82）%、（17.11±1.62）%、（26.53±4.28）%，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝9.15，P＜0.01）；在48h時間點(diǎn)對照組、預(yù)處理組、實(shí)驗組熒光強(qiáng)度分別為（3.28±0.95）%、（26.11±5.62）%、（39.50±6.14）%；3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝6.36，P＜0.05），說明CAT能部分阻斷細(xì)胞凋亡，見圖4、5。

3 討 論

線粒體途徑是細(xì)胞凋亡主要途徑之一，線粒體在啟動細(xì)胞凋亡過程中起重要作用［4－6］。細(xì)胞凋亡的早期表現(xiàn)之一為線粒體不可逆損傷，線粒體損傷后釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與凋亡蛋白活化因子1結(jié)合，能夠激活半胱氨酸門冬氨酸特異蛋白激酶的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA斷裂，凋亡形成。線粒體膜損傷后，因線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，造成線粒體內(nèi)、外膜間的離子自由通過，使線粒體膜電位下降，故線粒體膜電位改變量一定程度上反映線粒體損傷程度［7－8］。

眾多研究顯示姜黃素可誘導(dǎo)多種細(xì)胞的凋亡，對于其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制也在不斷探索中。本實(shí)驗觀察到姜黃素作用于肝癌SMMC－7721細(xì)胞后，在6、12h時間點(diǎn)均檢測到線粒體膜電位降低，12h時間點(diǎn)膜電位下降程度更低；在48h時間點(diǎn)檢測到細(xì)胞凋亡峰高于24h時間點(diǎn)，說明在一定范圍內(nèi)，姜黃素呈時間依賴性損傷細(xì)胞線粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在進(jìn)一步實(shí)驗中，檢測到姜黃素分別作用肝癌細(xì)胞1、2、3 h后，均迅速產(chǎn)生大量的H2O2，在2h時間點(diǎn)達(dá)高峰。這一現(xiàn)象發(fā)生在線粒體膜電位降低之前。H2O2能夠穿透大部分細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)的鐵離子反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，羥基自由基能使線粒體膜脂質(zhì)過氧化，形成的脂質(zhì)過氧化物對線粒體具有損傷作用。氧自由基能損傷線粒體，而線粒體損傷又可產(chǎn)生氧自由基，二者互為因果［9－12］。在生物體內(nèi)，CAT是一種重要的酶，能將H2O2還原成氧分子和水，維持細(xì)胞和機(jī)體的正常功能。已有實(shí)驗表明，CAT能在一定程度上減輕H2O2引起的凋亡［13－15］。本實(shí)驗也發(fā)現(xiàn)，加入CAT后，不僅 H2O2濃度降低，還能減輕線粒體膜電位下降程度，減少肝癌細(xì)胞凋亡數(shù)量。

［1］Reuter S，Eifes S，Dicato M，et al.Modulation of anti－apoptotic and survival pathways by curcumin as a strategy to induce apoptosis in cancer cells［J］.Biochem Pharmacol，2008，76（11）:1340－1351.

［2］Tong QS，Zheng LD，Lu P，et al.Apoptosis－inducing effects of curcumin derivatives in human bladder cancer cells［J］.Anticancer Drugs，2006，17（3）:279－287.

［3］Tharakan ST，Inamoto T，Sung B，et al.Curcumin potentiates the antitumor effects of emcitabine in an orthotopic model of human bladder cancer through suppression of proliferative and angiogenic biomarkers［J］.Biochem Pharmacol，2010，79（2）:218－228.

［4］楊家榮，楊慧，潘鐵軍.姜黃素對膀胱腫瘤細(xì)胞組織蛋白酶D表達(dá)的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2008，37（14）:1540－1543.

［5］胡太平，曾建國.芹菜素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制研究［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2007，27（1）:6－9.

［6］Henry－Mowatt J，Dive C，Martinou JC.Role of mitochondrial membrane pemeabilization in apoptosis and cancer［J］.Onco Gene，2004，23（16）:2850－2860.

［7］王通，曾耀英，邢飛躍，等.胸腺細(xì)胞和細(xì)胞器線粒體膜電位研究［J］.分子細(xì)胞生物學(xué)報，2006，39（2）:132－138.

［8］He Y，Wang J，Liu X，et al.Toosendanin inhibits hepatocellular carcinoma cells by inducing mitochondria－dependent apoptosis［J］.Planta Med，2010，76（13）:1447－1453.

［9］Xiao D，Powolny AA，Singh SV.Benzyl isothiocyanate targets mitochondrial respiratory chain to trigger reactive oxygen species－dependent apoptosis in human breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2008，283（14）:3015－3017.

［10］Bagchi－Rakshit S，Mandal L，Pal BC，et al.Involvement of ROS in chlorogenic acid－induced apoptosis of Bcr－Abl＋CML cells［J］.Biochem Pharmacol，2010，80（11）:1662－1675.

［11］Martín R，Ibeas E，Carvalho－Tavares J，et al.Natural triterpenic diols promote apoptosis in astrocytoma cells through ROS－mediated mitochondrial depolarization and JNK activation［J］.PLo S One，2009，4（1）:59－75.

［12］Xiao D，Powolny AA，Singh SV.Benzyl isothiocyanate targets mitochondrial respiratory chain to trigger reactive oxygen species－dependent apoptosis in human breast cancer cells［J］.J Biol Chem，2008，283（44）:5962－5965.

［13］Pallepati P，Averill－Bates DA.Mild thermotolerance induced at 40℃protects HeLa cells against activation of death receptor－mediated apoptosis by hydrogen peroxide［J］.Free Radic Biol Med，2010，151（4）:542－550.

［14］Lüpertz R，Chovolou Y，Kampktter A，et al.Catalase overexpression impairs TNF－alpha induced NF－kappa B activation and sensitizes MCF－7cells against TNF－alpha［J］.J Cell Biochem，2008，103（5）:1497－1511.

［15］Price M，Terlecky SR，Kessel D.A role for hydrogen peroxide in the pro－apoptotic effects of photodynamic therapy［J］.Photochem Photobiol，2009，85（9）:1491－1494.