嚴(yán)曉鶯，陳巨鵬，董菊，徐德國，趙鳳鳴，王明艷

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046，2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

《中國藥典》記載半夏為天南星科植物半夏的干燥塊莖;辛、溫;有毒;需炮制后使用。很多醫(yī)者認(rèn)為［1］生半夏治療惡性腫瘤臨床效果較好，而且經(jīng)過水煎，毒性降低，服用時較為安全。南京中醫(yī)藥大學(xué)張民慶教授應(yīng)用含有生半夏的滌痰化瘀方治療食道癌取得較好療效，且得到體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)［2－3］的證實(shí)。然而，生半夏在發(fā)揮治療作用的同時，對機(jī)體有無損傷，頗存爭議。本實(shí)驗(yàn)利用骨髓微核技術(shù)和精子畸形技術(shù)對生半夏水煎液遺傳毒性進(jìn)行評價，病理組織切片、HE染色對生半夏水煎液肝腎毒性進(jìn)行評價，探討生半夏水煎液的遺傳毒性與肝腎毒性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

ICR小鼠共25只，體質(zhì)量18～22g，購自上海斯萊克公司，合格證編號:2007000510241;飼養(yǎng)觀察3天后用于試驗(yàn)。試驗(yàn)動物的飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～25℃。自由采食、飲水，熟悉環(huán)境5日。

1.2 藥物

生半夏由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供。注射用環(huán)磷酰胺(CP，江蘇省恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號10051921)。

1.3 試劑

小牛血清;乙醇(分析純);甲醇(分析純);吉姆薩(Giemsa)染料;2%伊紅染液;氯化鈉注射液;蒸餾水。

1.4 儀器與器材

離心機(jī)(LXJ－64－01型離心機(jī)，北京);顯微鏡(Olympus光學(xué)顯微鏡，日本);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;吸管;1mL注射器;灌胃針;眼科剪;小平皿;濾紙;玻片;鑷子;血管鉗;漏斗。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 生半夏水煎液的制備

取100g生半夏，加蒸餾水200mL浸泡30min后煎煮，水沸后小火煎煮30min，濾出藥液;再加蒸餾水100mL煎煮30min，合并兩次濾液，濃縮為50mL，終濃度為2g/mL生藥。4℃冰箱保存待用，實(shí)驗(yàn)前以生理鹽水將藥液稀釋成所需的濃度。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

將25只小鼠隨機(jī)分為5組，即陰性對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組各5只。陰性對照組小鼠給予氯化鈉注射液0.25mL/20g/d灌胃給藥，連續(xù)10天;陽性對照組小鼠給予環(huán)磷酰胺40mg/kg處死前24h腹腔注射;低、中、高3個劑量組小鼠分別予1g/kg、5g/kg、25g/kg(根據(jù)成人臨床常用劑量換算，取其用量的4倍、20倍、100倍)的藥液灌胃，每24h 1次，連續(xù)10日。

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

給藥后第11天，頸椎脫臼法處死小鼠，剪取一側(cè)股骨，除去血污肌肉，剪掉股骨頭，用止血鉗擠出骨髓液，與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，待自然干燥后，以甲醇固定5～10min，再以Giemsa染液染色15min，蒸餾水沖洗、晾干。

鏡檢:油鏡下按一定順序進(jìn)行嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核計數(shù)。每只動物計數(shù)1 000個PCE，觀察含有微核PCE數(shù)，以千分率表示微核率。

2.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

分離小鼠雙側(cè)附睪，放入盛有2mL生理鹽水注射液的小試管中，縱向剪開附睪1～2刀，輕輕搖動3～5min，雙層濾紙過濾，吸取濾液涂片，空氣晾干。甲醇固定5～10min，2%伊紅染色1h，蒸餾水沖洗，晾干。

鏡檢:高倍鏡按順序檢查精子形態(tài)，每只動物檢查完整精子1 000個。并計數(shù)無鉤、香蕉頭、無定形、胖頭、雙頭、雙尾及尾折疊的畸形精子數(shù)，計算每組動物精子畸形百分率。

2.5 病理組織形態(tài)學(xué)檢測

取小鼠的肝臟、腎臟，計算肝臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)和腎臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量);肝臟、腎臟4%甲醛固定后，送江蘇省中醫(yī)院病理科檢測。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0進(jìn)行單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果

生半夏水煎液低、中劑量組誘發(fā)的微核頻率與陰性對照組相比，均無顯著性差異(P＞0.05);高劑量組誘發(fā)的微核與陰性對照組相比，有顯著差異(P＜0.05)，結(jié)果見表1，表明生半夏水煎液以25g/kg的劑量連續(xù)灌胃10天，能引起骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的升高。

表1 生半夏水煎液對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率影響(s)

表1 生半夏水煎液對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率影響(s)

注:與陰性組比較，*P ＜0.05。

組別 給藥劑量 觀察PCE數(shù) 微核總數(shù) 微核率(‰)陰性組(NS)0.25mL/只/d 5 000 3 0.6 ±0.89陽性組(CP)40mg/kg/d 5 000 91 18.2 ±3.42*生半夏低劑量組 1g/kg/d 5 000 6 1.2 ±1.30生半夏中劑量組 5g/kg/d 5 000 8 1.6 ±0.89生半夏高劑量組 25g/kg/d 5 000 16 3.2 ±1.64*

3.2 小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果

生半夏水煎液在各劑量組誘發(fā)的精子畸形率與陰性對照組相比，無顯著性差異(P≥0.05)，見表2。

表2 生半夏水煎液對小鼠精子畸形率影響(s)

表2 生半夏水煎液對小鼠精子畸形率影響(s)

組別 給藥劑量 觀察精子數(shù)畸形精子總數(shù)精子畸形率(‰)陰性組(NS)0.25ml/只/d 5 000 144 28.8 ±4.387生半夏高劑量組 25g/kg/d 5 000 131 26.2 ±2.387生半夏中劑量組 5g/kg/d 5 000 135 27.0 ±2.739生半夏低劑量組1g/kg/d 5 000 136 27.2 ±3.033

3.3 小鼠體質(zhì)量與肝、腎指數(shù)變化

各實(shí)驗(yàn)組在飼養(yǎng)期間體質(zhì)量均有增加，生半夏水煎液低、中、高劑量組體質(zhì)量較陰性組輕，并呈劑量依賴關(guān)系，但是P≥0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各劑量組的肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)與陰性組比較，P≥0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生半夏水煎液灌胃10天，對小鼠的體質(zhì)量、肝腎指數(shù)沒有影響，見表3。

表3 生半夏水煎液對小鼠體質(zhì)量和肝腎指數(shù)的影響(s)

表3 生半夏水煎液對小鼠體質(zhì)量和肝腎指數(shù)的影響(s)

分組 10天后體質(zhì)量 肝臟指數(shù)(×10－3)腎臟指數(shù)(×10－3)陰性組38.18 ±3.226 65.0 ±6.595 16.2 ±1.483生半夏低劑量組 38.14 ±1.865 61.4 ±5.237 17.4 ±0.894生半夏中劑量組 35.96 ±3.091 65.0 ±9.670 16.6 ±2.074生半夏高劑量組35.02 ±1.730 60.8 ±3.701 15.8 ±2.588

3.4 肝臟的HE染色

光鏡下觀察(見圖1):陰性組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞無水腫、壞死;間質(zhì)無炎細(xì)胞浸潤及纖維組織增生，未見血管及血竇擴(kuò)張;生半夏水煎液低劑量組肝細(xì)胞無明顯改變;中劑量組肝細(xì)胞輕度水腫，肝血竇擴(kuò)張充血;高劑量組肝細(xì)胞水腫，脂肪變性。說明高劑量的生半夏水煎液灌胃10天，對小鼠的肝臟細(xì)胞有損傷作用。

3.5 腎臟的HE染色

光鏡下觀察(見圖2):陰性組小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)完整，腎小管無水腫，未見管型，間質(zhì)未見炎細(xì)胞浸潤;中劑量組小鼠腎小管局部輕度水腫;高劑量組小鼠腎臟實(shí)質(zhì)內(nèi)散在灶性淋巴細(xì)胞浸潤，腎小管內(nèi)可見管型形成(見圖2)。提示高劑量的生半夏水煎液對小鼠腎臟有損傷作用，腎臟是生半夏毒性作用的靶器官之一。

圖2 小鼠腎臟HE染色

4 討論

骨髓多染紅細(xì)胞的微核試驗(yàn)是目前最常用的哺乳動物體內(nèi)遺傳毒學(xué)短期試驗(yàn)，用于評價體細(xì)胞的染色體受損情況，當(dāng)遺傳毒物作用有絲分裂期細(xì)胞，染色體發(fā)生斷裂，喪失著絲點(diǎn)，在細(xì)胞的有絲分裂后期，染色體應(yīng)有規(guī)律地進(jìn)入子細(xì)胞形成細(xì)胞核，而這些受損的染色體斷片仍然滯留在細(xì)胞質(zhì)中，形成微核。本實(shí)驗(yàn)低劑量和中劑量的生半夏水煎液未能引起骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的升高，而高劑量的生半夏可以引起骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的升高，說明在正常劑量下和療程內(nèi)生半夏對小鼠骨髓細(xì)胞沒有遺傳毒性，而在大劑量下可能對骨髓細(xì)胞有潛在的損傷，值得注意。

精子由生殖細(xì)胞產(chǎn)生，精子形態(tài)的正常與否受基因控制，當(dāng)遺傳毒物引起精子畸形，則提示有相關(guān)的基因及蛋白產(chǎn)物的改變［4］，故精子畸形試驗(yàn)可以反映藥物對生殖細(xì)胞基因的影響。本實(shí)驗(yàn)中三組劑量的生半夏水煎液均未引起小鼠精子畸形，考慮對小鼠生殖細(xì)胞有遺傳毒性的可能性不大。

肝臟和腎臟是藥物代謝和排泄的器官，也是對藥物進(jìn)行安全性評價的重要觀察對象，在對小鼠肝臟和腎臟的組織形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果顯示，低劑量組生半夏水煎液對小鼠的肝臟和腎臟沒有明顯影響;中劑量組對小鼠的肝臟和腎臟影響較小;高劑量組對小鼠的肝臟和腎臟有一定的毒性。

綜合上述結(jié)果，初步提示大劑量的生半夏水煎液對體細(xì)胞可能有一定毒性。進(jìn)一步研究半夏復(fù)方的增效解毒打下基礎(chǔ)，并為生半夏的臨床合理應(yīng)用提供參考。

［1］張成銘.大劑量生半夏治療惡性腫瘤16例［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，9(6):108 －109.

［2］張民慶，陳華圣，許愛華，等.滌痰祛瘀湯對小鼠腫瘤的抑制作用及其機(jī)制探討［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2001，17(4):221 －222.

［3］王明艷，許冬青，劉華東，等.滌痰化瘀湯對人食管癌Eca－109細(xì)胞ras p21 p53基因表達(dá)影響的研究［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(3):530－531.

［4］袁伯俊，廖明陽，李波.藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:294－295.