李文軍，楊波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

濟(jì)川煎一方出自明·張景岳的《景岳全書》，方由當(dāng)歸、牛膝、肉從蓉、澤瀉、升麻、枳殼六味中藥組成，現(xiàn)代臨床常用于治療功能性便秘，偏于腎虛精虧患者。為了有效地控制制劑質(zhì)量，本文對(duì)與該制劑中當(dāng)歸和肉蓯蓉兩味主藥進(jìn)行了薄層定性鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定枳殼中柚皮苷的含量，建立有效的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀;硅膠G薄層板(青島海洋化工公司);柚皮苷對(duì)照品(110722－200610)、當(dāng)歸對(duì)照藥材(120927－200613)、松果菊苷對(duì)照品(111670－200503)、毛蕊花糖苷對(duì)照品(111530－200706)(中國藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純?cè)噭?水為重蒸水;其他試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

濟(jì)川煎顆粒(批號(hào)100101)由哈藥集團(tuán)中藥二廠提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 TCL鑒別方法的建立

2.1.1 肉蓯蓉

取本品5g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50ml，超聲處理15min，濾過，濾液水浴濃縮至干，殘?jiān)蛹状?ml超聲使溶解，作為供試品溶液。

分別取松果菊苷對(duì)照品、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg松果菊苷和毛蕊花糖苷的對(duì)照品溶液。

照處方工藝制備缺肉蓯蓉的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

分別吸取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液各2～5μl，點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，用甲醇 －醋酸 －水(2∶1∶7)展開，距邊緣 2cm 時(shí)取出，室溫晾干后，在365nm紫外光燈下檢視。結(jié)果供試品色譜中，可檢視出松果菊苷與毛蕊花糖苷斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.1.2 當(dāng)歸

取本品5g，加熱水50ml使溶解，加入乙醚振搖提取2次，每次用量50ml，合并乙醚萃取液，水浴揮干，殘?jiān)尤爰状?ml超聲使溶解，作為供試品溶液。

取當(dāng)歸對(duì)照藥材 0.3g，加水 50ml，超聲處理20min，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。

照處方工藝制備缺當(dāng)歸的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

分別吸取對(duì)照藥材、供試品、陰性對(duì)照溶液各2～5μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用環(huán)己烷－乙酸乙酯(9∶1)展開，距邊緣2cm時(shí)取出，室溫晾干后，在365nm紫外光燈下檢視。結(jié)果供試品色譜中，可檢視出相應(yīng)的對(duì)照藥材熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.2 含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱:YMC C18(4.6mm ×250mm，5μm);檢測(cè)波長:283nm;流動(dòng)相:乙腈 － 水(20∶80);流速:1.0ml/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10μl。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取柚皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.17mg柚皮苷的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，混和均勻，研細(xì)，取3g，精密稱定，置100ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，密塞，稱定重量，放置30min，超聲處理(功率320W，頻率40kHz)40min，取出，放置至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，靜置30min，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 照處方工藝制備缺枳殼的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性研究 分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照溶液在柚皮苷色譜峰對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處未見色譜峰，說明方法專屬性較強(qiáng)。見圖1。

圖1 柚皮苷含量測(cè)定HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液 2、4、8、10、12、16、20μl，注入液相色譜儀，按擬定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程Y=1 672.8X+29.2，r=0.999 9(n=7)，表明柚皮苷在0.34μg～3.4μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.7 耐用性試驗(yàn)

2.2.7.1 提取溶劑選擇

分別以水、50%甲醇、甲醇溶液作為提取溶劑，超聲提取30min，結(jié)果50%甲醇溶液柚皮苷的提取率最高，因此確定提取溶劑為50%甲醇溶液。

2.2.7.2 提取時(shí)間的選擇

以50%甲醇溶液作為提取溶劑，超聲提取時(shí)間分別定為 20min、40min、60min，結(jié)果顯示 40min已提取完全，因此超聲提取時(shí)間定為40min。

2.2.7.3 色譜柱柱溫的選擇

比較了不同的色譜柱柱溫:25℃、30℃、40℃，結(jié)果柱溫25℃、30℃時(shí)均能得到較好分離，40℃時(shí)分離度較差。因此選擇柱溫為30℃。

2.2.7.4 色譜柱的選擇

選擇四個(gè)不同廠家的色譜柱，1)Agilent TC－C18(250mm ×4.6mm，5μm);2)Phenomenex C18(250mm ×4.6mm，5μm);3)Ymc－Pack ODS－A(250mm ×4.6mm，5μm);4)Thermo BDS HYPERSIL C18(250mm×4.6mm，5μm)。結(jié)果在該色譜條件下，以 Ymc－Pack ODS－A分離效果最好，因此選擇Ymc－Pack ODS－A為本分析方法色譜柱。

2.2.7.5 室溫條件下溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取上述供試品溶液 10μl，分別在 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9h按照含量測(cè)定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算得峰面積積分值RSD為0.16%(n=10)，結(jié)果表明供試品溶液在9h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 柚皮苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批濟(jì)川煎顆粒樣品(批號(hào)100101)，按照擬定的含量測(cè)定方法中供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，分別測(cè)定其中柚皮苷的含量。結(jié)果柚皮苷平均含量為3.218mg/g，RSD為1.10%(n=6)。

2.2.9 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收率法，將柚皮苷對(duì)照品定量加入到樣品溶液中，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果柚皮苷的平均回收率99.96%，RSD為1.62%(n=6)。

3 討論

對(duì)濟(jì)川煎中當(dāng)歸、肉蓯蓉進(jìn)行薄層鑒別，斑點(diǎn)顯色清晰，陰性無干擾，表明該鑒別方法專屬性較強(qiáng)，可用于本品質(zhì)量的監(jiān)控。此外還對(duì)升麻、澤瀉的薄層鑒別進(jìn)行了研究，但升麻薄層鑒別，陰性有干擾，澤瀉薄層鑒別方法專屬性不強(qiáng)，因此不作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

采用高效液相色譜法測(cè)定本品中的柚皮苷含量，結(jié)果分離效果較好，并且耐用性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)結(jié)果均符合含量測(cè)定分析要求，方法簡便易行。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國藥典［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］楊明，何廣新.藥材肉蓯蓉活性成分的研究和開發(fā)［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2004，69(4):236.

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