朱美霖， 白宏英， 曾志磊， 張沛琳

腦缺血后血管再生正在受到越來越多的關注，研究表明腦缺血后血管再生能夠盡快恢復缺血區(qū)的血供，挽救瀕臨死亡的神經(jīng)元［1，2］。腦缺血后，缺血組織釋放細胞因子動員內(nèi)皮祖細胞，使其歸巢并通過自身的分化、增殖形成新生血管。新生血管可以為組織細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧，進而改善局部血供，縮小梗死灶［3］，有助于腦缺血患者缺損的神經(jīng)功能恢復。Sonic hedgehog信號通路(SHH)與血管再生有著密切的聯(lián)系，Kusano［4］等發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠外周神經(jīng)病變中加入外源性SHH可以誘導神經(jīng)血管生成。SHH信號通路可影響眾多血管新生因子，如VEGF和CD105等，從而調(diào)控血管生成。VEGF是血管生成的主要調(diào)控因子，CD105是血管再生所必需的，其表達與新生血管內(nèi)皮細胞相關。既往對SHH信號通路對腦缺血后血管再生的研究甚少，本實驗擬用purmorphamine激活SHH信號通路，以探究SHH信號通路激活對腦缺血后血管再生因子的影響，為腦缺血治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 動物分組及給藥方法 健康成年雄性SD大鼠108只，清潔級，體重280～350g(由河南省實驗動物中心提供)，給予標準的飼料，自由進食進水。SD大鼠隨機分為3組，即A組:假手術組(n=12);B組:模型組(n=48);C組:給藥組(n=48)。其中B組和C組按時間分為4個亞組即6h、12h、24h、48h，每亞組12 只。C 組于術后按0.69/mg給予purmorphamine溶液腹腔注射，A組和B組于術后給予等劑量的DMF溶液注射。

1.2 藥品與試劑 purmorphamine粉劑(T.R.C，CAS:483367-10-8)購自上海凱試公司。使用前先用DMF溶解，再用PBS溶液稀釋。VEGF兔抗鼠多克隆抗體、CD105兔抗鼠多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ。SP9000試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉生物工程公司。PCR試劑盒、內(nèi)參β-actin、DEPC水、逆轉錄試劑盒、Trizol均購于北京全式金生物技術有限公司。

1.3 缺血模型的制備 參照Zea longa［5］等報道的線栓法制作SD大鼠永久性大腦中動脈缺血模型。假手術組僅分離頸總動脈及其分支，并不插入線栓和結扎。術中大鼠體溫保持37℃。于大鼠清醒1h后進行神經(jīng)功能評分，評分標準參照Zea longa 5分制評分標準。0分，無任何神經(jīng)缺損癥狀;1分，不能完全伸直對側前爪;2分，向?qū)绒D圈;3分，向?qū)葍A倒;4分，不能自由行走;5分，死亡。其中評分1～4分入選后續(xù)試驗，如在實驗過程中有死亡或者不符合要求的大鼠，取同批次大鼠補足數(shù)量。

1.4 標本制備 10%水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛心臟灌洗固定24h備用。石蠟包埋后連續(xù)切片，制備成4μm厚度切片。

1.5 免疫組化測定缺血半暗帶區(qū)域VEGF和CD105的表達 采用SP法，按照說明書操作。每張切片隨機選取10×40視野5個，應用圖像分析系統(tǒng)進行光密度分析。

1.6 RT-PCR檢測缺血半暗帶內(nèi)PTCH-1 mRNA的表達情況 10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦，液氮冷凍后放置-80℃冰箱保存。按試劑盒說明書提取出腦組織總RNA，逆轉錄合成cDNA后進行擴增。擴增上游引物為5’-AAATGCTGAATAAAGCCGAAGT-3’，下游引物為 5’-GTGCCACCCACAATCAACTC-3’，擴增條件如下:94℃預變性2min，1 個循環(huán);94℃變性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸2min，共計35個循環(huán);72℃延伸6min。實驗中以β-actin作為內(nèi)參。PTCH長度為199bp，擴增后得到所需目的基因經(jīng)過電泳鑒定后采用圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，目的基因PTCH-1的表達量與β-actin的DNA條帶灰度比值進行計算。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，取α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 PTCH-1 mRNA表達情況 與A組比較，B組和C組PTCH-1 mRNA表達增高。差異具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。B組和C組缺血半暗帶區(qū)域的PTCH-1 mRNA表達于腦缺血6h后開始升高，24h達高峰，之后有所下降但仍維持在較高水平。但與C組各時間點PTCH-1 mRNA與B組相比較表達顯著增高，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表1)。

2.2 VEGF表達情況 A組中大鼠腦組織中VEGF存在少量陽性細胞表達，B組和C組6h表達量開始增加，于48h表達最為顯著。陽性表達區(qū)域主要存在于皮層下區(qū)和海馬區(qū)的梗死灶周圍。C組與A組、B組相比較各時間點陽性細胞數(shù)表達明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表2、圖1)。

2.3 CD105測定結果 A組CD105弱表達，B組于腦缺血后6h表達開始增高，且隨著時間增加表達逐漸增高，C組與B組各時間點相比較CD105表達明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表3)。

表1 大鼠腦組織中各個時間點PTCH-1mRNA表達(n=6，)

表1 大鼠腦組織中各個時間點PTCH-1mRNA表達(n=6，)

與A組相比*P＜0.05;與B組相比△P＜0.05

組別/時間點6h 12h 24h 48h A組B組C組0.085 ±0.006 0.102 ±0.007*0.116 ±0.009＊△0.097 ±0.008 0.376 ±0.019*0.549 ±0.032＊△0.093 ±0.007 0.537 ±0.024*0.7411 ±0.444＊△0.0927 ±0.005 0.409 ±0.0140*0.550 ±0.020＊△

表2 大鼠腦組織各時間點VEGF表達(平均光密度)(n=6，)

表2 大鼠腦組織各時間點VEGF表達(平均光密度)(n=6，)

與A組相比*P＜0.05;與B組相比△P＜0.05

組別/時間點6h 12h 24h 48h A組B組C組99.36 ±3.29 107.04 ±4.59*116.69 ±7.14＊△99.37 ±3.29 130.71 ±6.72*132.73 ±10.55＊△105.27 ±5.18 136.20 ±10.00*148.04 ±13.17＊△99.37 ±3.29 145.47 ±7.85*159.24 ±9.91＊△

表3 大鼠腦組織各時間點CD105表達(平均光密度)(n=6，)

表3 大鼠腦組織各時間點CD105表達(平均光密度)(n=6，)

與A組相比*P＜0.05;與B組相比△P＜0.05

組別/時間點6h 12h 24h 48h A組B組C組58.94 ±3.02 87.03 ±6.012*118.24 ±6.85＊△58.94 ±3.02 114.03 ±7.36*143.93 ±7.18＊△66.95 ±2.84 121.60 ±7.23*163.85 ±5.08＊△68.58 ±2.78 137.49 ±6.53*162.25 ±4.4＊△

3 討論

腦缺血后，缺血區(qū)血管再生范圍和程度影響了缺血區(qū)的血流灌注，增加缺血區(qū)血供或者促進血管再生可加快腦缺血后損傷腦組織的修復。近些年研究發(fā)現(xiàn)SHH信號通路與血管再生有著密切關系。Kusano等［6］研究發(fā)現(xiàn)SHH通路可以誘導局部缺血組織血管再生，且SHH誘導血管新生的能力強于VEGF。Pola R等［7］在研究SHH通路時指出SHH通路可以通過上調(diào)VEGF和ANG誘導形成較大直徑的血管。SHH信號通路誘導血管再生可能是通過SHH/GLI/SMO通路實現(xiàn)的，SHH信號通路通過PTCH和SMO兩個轉錄因子對靶細胞進行調(diào)控。當SHH信號通路處于靜止期時，PTCH與SMO結合抑制SMO活性。當SHH通路被激活時，SHH蛋白與PTCH結合，PTC/SMO復合物釋放SMO活性，SMO激活下游GLI從而誘導目的基因的表達。SHH不足時，PTCH-1表達降低，SHH通路激活時，PTCH-1表達增加。因此PTCH-1常作為檢測SHH信號通路活化的標志分子［8］。本課題通過PCR測定PTCH-1反映SHH信號是否處于激活狀態(tài)。

purmorphamine是一種小分子嘌呤衍生物，分子量為520.62，可透過血腦屏障。purmorphamine與SMO結合后SMO蛋白空間構象發(fā)生改變從而激活SHH通路下游分子。本研究發(fā)現(xiàn)PTCH-1在腦缺血后6h表達有所增加，提示腦缺血后存在內(nèi)源性的SHH信號通路激活，這與既往研究結果一致。加入purmorphamine溶液后，PTCH-1表達明顯增加，24h升高最為顯著，48h有所降低，與模型組相比有統(tǒng)計學意義，提示給予外源性SHH信號通路激活劑purmorphamine可以有效激活SHH信號通路，但具有時效性，隨著時間推移，這種效應逐漸減弱，難以持續(xù)激活SHH信號通路。

VEGF是血管生長的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，在內(nèi)皮細胞分化和神經(jīng)形成過程中參與早期血管生成，促進血管內(nèi)皮細胞存活和增殖，加速形成新生血管。CD105(endoglin)通過對TGF-β調(diào)控影響血管再生，也是血管再生中必需的因子。CD105在正常組織幾乎不表達，但是在新生血管強表達，可以作為新生血管內(nèi)皮細胞特異標志物。有研究表明CD105測定的血管密度是一個獨立的指標，能定量區(qū)別新生血管和已存在的血管［9］。本研究結果發(fā)現(xiàn)在腦缺血后6h促血管再生因子VEGF和新生血管標志物CD105表達開始增多，于48h升高最為顯著，提示腦缺血可刺激體內(nèi)的內(nèi)源性VEGF和CD105表達，應用purmorphamine后，VEGF和CD105的表達均明顯增加，提示激活SHH通路后可上調(diào)VEGF和CD105表達，促進血管再生。另外，應用purmorphamine后，PTCH-1的表達高峰在24h，而VEGF和CD105表達高峰有一定延遲，提示SHH信號通路激活促進血管再生的效應不是即刻的，這可能與SHH信號通路下游分子較多有關，也可能與相關蛋白的分泌表達時間有關。

可否連續(xù)應用外源性激活劑purmorphamine激活SHH通路而形成對血管再生的持續(xù)效應有待于進一步研究。

圖1 免疫組化測定各時間點VEGF表達情況(A:假手術組;B:模型組;C:給藥組)

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