王多佳，李鳳蘭，任明玄，胡寶忠

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

黃瓜（CucumissativusL.）為葫蘆科（Cucurbitaceae）甜瓜屬（Cucumis）一年生草本攀援植物，是重要的蔬菜作物，栽培廣，面積大，在蔬菜供應(yīng)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中均占有重要地位[1]。我國(guó)是世界上黃瓜生產(chǎn)面積最大、總產(chǎn)量最高的國(guó)家。我國(guó)廣泛栽培的黃瓜品種多為蔓生品種，由于植株高大，需要人為搭架，造成大量的人力、物力的浪費(fèi)，嚴(yán)重地影響了我國(guó)黃瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。矮生性狀是高等作物理想株型性狀的一個(gè)重要方面，矮化（桿）品種抗倒伏能力強(qiáng)，適宜高度密植，群體光能利用率高[2-3]。本文中所用矮化黃瓜D0462，其表型為植株矮?。ㄖ挥?0 cm高），節(jié)間縮短，幾乎不分枝，呈現(xiàn)出直立、緊湊的株型。

膨脹素（Expansin）是植物細(xì)胞壁松弛蛋白，主要參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、伸長(zhǎng)和一系列細(xì)胞壁的修飾過(guò)程。它能緩釋細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)網(wǎng)中的張力，使細(xì)胞壁變得松弛，因此多被譯為膨脹素[4]。Cs-EXPA1基因是最早在黃瓜下胚軸中被發(fā)現(xiàn)的膨脹素基因，在對(duì)膨脹素近十年的研究中發(fā)現(xiàn)，它參與了許多植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控，比如細(xì)胞生長(zhǎng)、葉原基的產(chǎn)生、花粉管滲入、果實(shí)成熟、細(xì)胞壁降解、種子的生長(zhǎng)和萌發(fā)等，而且它還對(duì)淹水、光處理、旱脅迫等產(chǎn)生反應(yīng)[5-8]。但與矮化的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，因此開(kāi)展黃瓜矮化突變體膨脹素基因的分離克隆研究，這將對(duì)于探討植物的矮化機(jī)理具有重要作用。

本研究克隆了黃瓜下胚軸、根、子葉組織中的膨脹素基因Cs-EXPA1，研究了它在黃瓜生長(zhǎng)苗期不同部位的表達(dá)量差異，通過(guò)與正常株高的對(duì)照組的表達(dá)量比較，探討了膨脹素基因在矮化黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，為利用基因工程技術(shù)改變膨脹素在矮化植株中的表達(dá)以便增加作物產(chǎn)量提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

矮化黃瓜D0462，對(duì)照材料為長(zhǎng)蔓正常株高品種129，均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。在培養(yǎng)箱中28℃光培養(yǎng)16 h，25℃暗培養(yǎng)8 h，分別于破土后16、24、40、48、64、72、88、96 h取D0462和129的下胚軸、根和子葉作為試材。

1.2 RNA的提取、cDNA的合成及黃瓜Cs-EXPA1基因的克隆

用Trizol法（Invitrogen公司）提取RNA，用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈，根據(jù)Cs-EXPA1序列（GenBank登錄號(hào)U30382.1），設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，上游R1：5'TTCGCTAATCTCCCCTTTCTTCC 3'， 下 游 R2： 5'GTCGTTCGCGTTTTGTTGTTGTT 3'。以第1鏈cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃5 min；94℃30 s；57℃30 s；72℃30 s；共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物從1%瓊脂糖凝膠上回收后，克隆入pMD-18T載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒鑒定后由南京博仕公司測(cè)序。

1.3 Cs-EXPA1基因在苗期不同組織中的Realtime PCR表達(dá)分析

TaqMan探針?lè)y(cè)定Cs-EXPA1基因的不同時(shí)空表達(dá)情況，利用Primer Express 2.0設(shè)計(jì)熒光定量探針引物。在檢測(cè)探針?biāo)诎行蛄械膬啥嗽O(shè)計(jì)普通引物，擴(kuò)增200～500 bp片段作為陽(yáng)性克隆基因。引物序列為上游：5'TACTTCAACCTCGTTTTGATCACA 3'；下游：5'CGAGACCCCTTTATCGACACA 3'；探針：FAM-TGGCGCAGGCGACGTCCA-BHQ1。以黃瓜β-actin為內(nèi)參，上游：5'GTGTGAGTCACACTG TTCCCATC 3'；下游：5'AGCAAGGTCCAAACGG AGAA 3'；內(nèi)參探針：FAM-AGGGTTACGCCCTCC CTCATGCC-BHQ1。由南京博仕公司合成。預(yù)變性95℃30 s，PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，95℃5 s，60℃34 s。Real-time PCR用ABI7500熒光定量PCR儀，按照試驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)PCR的擴(kuò)增曲線，設(shè)3次重復(fù)，根據(jù)2-ΔΔct法測(cè)定基因的相對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cs-EXPA1基因的克隆

采用Trizol試劑盒（Invitrogen）提取苗期黃瓜D0462和129的下胚軸、根、子葉的總RNA，取1 μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板，反轉(zhuǎn)錄體積10 μL，分別取2 μL做模板，以R1、R2為引物擴(kuò)增目的基因，按照擴(kuò)增條件，35個(gè)循環(huán)，1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示。將目的片段膠回收，并與pMD-18T（TaKaRa）載體連接，轉(zhuǎn)化，挑取白斑，經(jīng)測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 Cs-EXPA1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of Cs-EXPA1

2.2 Cs-EXPA1基因在苗期不同組織中的Realtime PCR表達(dá)分析

Cs-EXPA1基因在黃瓜矮化突變體D0462和正常品種129下胚軸中的變化趨勢(shì)相似，如圖3所示，在96 h內(nèi)的生長(zhǎng)時(shí)期中都有表達(dá)量的峰值，D0462在64 h處達(dá)到峰值，幾乎是平均水平的70倍，隨后急劇下降，品種129則在72 h處達(dá)到峰值，表達(dá)量是平均水平的15倍左右。在其他的測(cè)試時(shí)間內(nèi)，D0462的表達(dá)量都略高于129。

從圖4中我們可以看出，品種129子葉中Cs-EXPA1的表達(dá)量要遠(yuǎn)大于D0462，矮化突變體的子葉中Cs-EXPA1的表達(dá)基本保持在低水平上，但是品種129中子葉的Cs-EXPA1基因從24 h后逐漸增加，到64 h后達(dá)到峰值，隨即降低，到96 h時(shí)與D0462的表達(dá)量基本持平。說(shuō)明在24～72 h之內(nèi)是正常黃瓜子葉膨脹素基因Cs-EXPA1大量表達(dá)的重要時(shí)期。

圖2 Cs-EXPA1基因在NCBI上的比對(duì)結(jié)果Fig.2 Blast result of Cs-EXPA1 in NCBI website

圖3 Cs-EXPA1基因在黃瓜下胚軸中的表達(dá)Fig.3 Expression of Cs-EXPA1 gene in hypocotyl of cucumber

圖4 Cs-EXPA1基因在黃瓜子葉中的表達(dá)Fig.4 Expression of Cs-EXPA1 gene in cotyledon of cucumber

從圖5中我們可以看出，根中Cs-EXPA1基因的表達(dá)相對(duì)于下胚軸和子葉來(lái)說(shuō)表達(dá)量很少，對(duì)于D0462，其根中Cs-EXPA1的表達(dá)基本沒(méi)有顯著的增長(zhǎng)或者降低，基本保持在相當(dāng)少的水平上，只在24和88 h時(shí)略微增長(zhǎng)，而正常品種129根中Cs-EXPA1則在96 h處顯著增加，達(dá)到平均水平的10倍左右。這也說(shuō)明此時(shí)129根中膨脹素基因的開(kāi)始大量表達(dá)并對(duì)根細(xì)胞起作用。

圖5 Cs-EXPA1基因在黃瓜根中的表達(dá)Fig.5 Expression of Cs-EXPA1 gene in roots of cucumber

3 討論與結(jié)論

膨脹素是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的迄今唯一能誘導(dǎo)熱鈍化的離體細(xì)胞壁伸展的細(xì)胞壁特異性蛋白質(zhì)。在控制植物細(xì)胞生長(zhǎng)方面，能調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的膨脹，可以通過(guò)生長(zhǎng)素調(diào)控，引起pH下降，激活膨脹素及相關(guān)水解酶，引起木葡聚糖或（1，3），（1，4）-β-D-葡聚糖（MLG）等半纖維素的降解，打斷半纖維素與纖維素微纖絲之間的氫鍵，改變細(xì)胞壁的承重網(wǎng)絡(luò)，從而加速生長(zhǎng)[9-10]。此外，膨脹素對(duì)植物發(fā)育也起一定的調(diào)控作用，但只在正確的位置和時(shí)間內(nèi)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，是細(xì)胞壁中的一種發(fā)育決定成分。

本研究獲得的Cs-EXPA1是最早在黃瓜下胚軸中發(fā)現(xiàn)的膨脹素蛋白基因之一，從本試驗(yàn)中可以確定該基因在子葉與根中都有表達(dá)，并且通過(guò)Real-time PCR定量分析得出Cs-EXPA1基因在不同的部位的表達(dá)量不同，膨脹素Cs-EXPA1基因在下胚軸中的表達(dá)量最高，在子葉中次之，在根中的表達(dá)量最低。并且Cs-EXPA1基因的表達(dá)具有時(shí)空特異性，隨時(shí)間的變化，在不同組織部位或同一組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)活性各不相同，這與前人得到的結(jié)果一致[11-13]。

同時(shí)，矮化黃瓜與正常長(zhǎng)蔓品種相比膨脹素Cs-EXPA1基因的表達(dá)量也有明顯差異，在矮化黃瓜D0462的子葉和根中Cs-EXPA1的表達(dá)量要小于正常的黃瓜品種129，并且隨時(shí)間變化不大，但在下胚軸中64 h的表達(dá)量卻遠(yuǎn)大于品種129。據(jù)報(bào)道，黃瓜植株株高是由單基因體系和多基因體系共同決定的[14]，所以，在矮化黃瓜中膨脹素Cs-EXPA1單個(gè)基因的表達(dá)量不能決定植株的矮化。

膨脹素活性也是重要的因素，Cosgrove等在研究燕麥胚芽鞘時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)黑暗培養(yǎng)4 d的燕麥胚芽鞘照白光處理，8～10 h之后，生長(zhǎng)陡然停止，外源生長(zhǎng)素也不能誘導(dǎo)生長(zhǎng)恢復(fù)[15]，同時(shí)，細(xì)胞壁中的廣泛生長(zhǎng)因子膨脹素的活性沒(méi)有下降，只是量上有稍微的降低，隨著照光的持續(xù)，生長(zhǎng)才逐漸恢復(fù)[16]。推測(cè)光照對(duì)膨脹素活性的調(diào)控有很大的影響。

目前，蔬菜作物上矮化基因的研究尚處于起步階段，不同株型的矮生類(lèi)型如何利用也有待深入研究，另外，利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行矮化機(jī)理的研究也比較薄弱，同時(shí)膨脹素如何促使植物細(xì)胞壁松弛與伸長(zhǎng)的具體機(jī)制尚不清楚，這都有待進(jìn)一步研究。

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