曾彥達(dá)，石曉艷，馬鳳鳴

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）是植物硝態(tài)氮同化過(guò)程中一個(gè)十分重要的酶，其與硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）偶聯(lián)完成NO3-的無(wú)機(jī)同化[1]，該酶催化NO2-還原為NH4+，以NADPH為電子供體在白色體中完成，在硝酸鹽降解生成銨這一過(guò)程中起到承前啟后的作用。NiR是植物體中NO2-同化過(guò)程的控制酶，其基因與NR都受NO3-的調(diào)節(jié)表達(dá)有關(guān)[2]；Faure等研究發(fā)現(xiàn)，在白化煙葉片中的NR和NiR轉(zhuǎn)錄同時(shí)積累，當(dāng)?shù)退降腘R活性恢復(fù)后，NiR的活性水平也恢復(fù)正常，并把這種表達(dá)過(guò)程中的NR與NiR的相互作用稱(chēng)為NR和NiR的偶聯(lián)調(diào)節(jié)[3]。目前，與NR相比較，有關(guān)NiR研究尚少。

NiR基因結(jié)構(gòu)的研究始于上個(gè)世紀(jì)80年代末期，Lahners等提出了玉米NiR分子結(jié)構(gòu)[4]。繼后，在菠菜、水稻、煙草、擬南芥等高等植物中已克隆了NiR的基因[5-7]，在甜菜上鮮有報(bào)道而且研究并不詳細(xì)。本研究克隆了甜菜亞硝酸還原酶基因，對(duì)其核苷酸和氨基酸序列以及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，有利于研究清楚甜菜這一特定作物編碼NiR的基因及其表達(dá)和調(diào)控問(wèn)題，可為植物營(yíng)養(yǎng)與分子生理學(xué)填補(bǔ)基礎(chǔ)性資料；為改造基因和基因操作奠定基礎(chǔ)，尤其是研究由環(huán)境條件引起的mRNA和特異蛋白質(zhì)差異變化，將對(duì)甜菜NiR基因操作表達(dá)及表達(dá)時(shí)環(huán)境條件影響的機(jī)制提供分子生物學(xué)的解釋?zhuān)粸槿娣治鯪R和NiR的偶聯(lián)作用提供分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)，有助于研究制定更為合理的施肥措施，培育甜菜氮高效利用品種，降低施肥費(fèi)用，提高種植甜菜的經(jīng)濟(jì)效益，改善和防止因過(guò)量施肥所導(dǎo)致硝酸鹽和亞硝酸鹽積累造成的生態(tài)污染。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用甜菜品種為甜研7號(hào)，種子在室溫下浸種12 h，然后置于培養(yǎng)皿中25℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，移栽于培養(yǎng)缽中，待幼苗長(zhǎng)至4～6片葉后，剪取完全伸展的幼苗葉片，提取總RNA和基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

參照Trizol的說(shuō)明書(shū)方法提取總RNA，電泳后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照。選擇完整性好，質(zhì)量高的RNA進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.2 甜菜NiR基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

使用寶生物公司的RACE試劑盒克隆基因的末端序列。參照NCBI上甜菜NiR基因cDNA的部分序列（登陸號(hào)：AF173663），以及菠菜、大豆NiR序列保守區(qū)分別設(shè)計(jì)3′/5′特異引物。設(shè)計(jì)兩條正向嵌套引物3′-RACE Outer SP和3′-RACE inner SP，3′-RACE Outer SP與試劑盒引物3′Outer primer進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，產(chǎn)物稀釋5倍作為模板，3′-RACE Inner SP 與3′Inner primer進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)5′端特異反轉(zhuǎn)錄引物5′-RACE Outer AP 和5′-RACE Inner AP，5′-RACE Outer AP與5′Outer primer進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，產(chǎn)物直接作為模板，5′-RACE Inner AP和5′Inner primer進(jìn)行第二輪巢式擴(kuò)增。將已知的中間序列與3′端和5′端序列拼接后得到基因全長(zhǎng)。克隆甜菜NiR基因引物見(jiàn)表1，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR擴(kuò)增的特異片段按照寶生物膠回收試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行回收。回收的目的片段連接到pMD19-T載體（TaKaRa）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109（TaKaRa），進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，使用菌落PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小；將白斑接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取陽(yáng)性克隆菌液由上海生物工程公司測(cè)序。根據(jù)所得甜菜NiR基因的末端序列設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR，克隆NiR基因cDNA序列全長(zhǎng)。

表1 甜菜NiR基因特異引物Table 1 Primers for cloning of sugar beet NiR gene

1.2.3 甜菜NiR基因組DNA（gDNA）的克隆

依據(jù)NiRcDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增NiRgDNA的全長(zhǎng)序列。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 1 min，94℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)，72℃10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增的特異片段按照寶生物膠回收試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行回收。回收的目的片段連接到pMD19-T載體（TaKaRa）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109（TaKaRa），進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，使用菌落PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小；將白斑接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取陽(yáng)性克隆菌液由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析

測(cè)序得到的NiRcDNA序列利用NCBI網(wǎng)站提供的ORF Finder找出基因的讀碼框，然后利用瑞士生物信息學(xué)研究所提供的ProtParam等網(wǎng)站進(jìn)行氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、平均疏水性及三維結(jié)構(gòu)等參數(shù)在線分析[8-9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜NiR cDNA序列的克隆

以甜菜總RNA為模板，根據(jù)甜菜NiRcDNA已知的中間片段設(shè)計(jì)了3′/5′RACE的引物，分別經(jīng)過(guò)兩輪巢式PCR擴(kuò)增，得到了一條約1 640 bp和一條約437 bp左右的條帶，與預(yù)期片段大小基本相符。將兩片段克隆，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，克隆所得片段與中間片段都具有重疊區(qū)，且含有poly（A）結(jié)構(gòu)。同時(shí)將中間片段和RACE產(chǎn)物的拼接序列設(shè)計(jì)特異引物cDNA全長(zhǎng)SP和cDNA全長(zhǎng)AP，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到序列對(duì)比拼接序列，發(fā)現(xiàn)二者相同。再將該序列進(jìn)入NCBI比對(duì)，結(jié)果顯示全序列與同為藜科植物的菠菜NiR序列相似度達(dá)到了83%，表明所克隆的片段正是甜菜NiR的3′末端和5′末端序列。結(jié)果表明，該cDNA全長(zhǎng)為2 014 bp，含有1 830 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼599個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，登錄號(hào)為HQ224499（見(jiàn)圖1）。

圖1 甜菜NiR cDNA擴(kuò)增Fig.1 Amplification of sugar beet NiR cDNA

2.2 甜菜NiR gDNA序列的克隆

以甜菜總DNA為模板，根據(jù)已克隆甜菜NiRcDNA序列設(shè)計(jì)特異引物gDNA全長(zhǎng)SP和gDNA全長(zhǎng)AP，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到甜菜NiRgDNA編碼序列，登錄號(hào)為HQ419065，總長(zhǎng)度為2 815 bp，含有4個(gè)外顯子和有3個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為532、136、270 bp（見(jiàn)圖2）。

圖2 甜菜NiR gDNA擴(kuò)增Fig.2 Amplification of sugar beet NiR gDNA

2.3 序列分析

2.3.1 不同植物NiR蛋白分子進(jìn)化樹(shù)分析

在BLASTp分析的基礎(chǔ)上[10-11]，選擇與其同源性較高的幾條序列做N-J聚類(lèi)分析，以期對(duì)Ty7 NiR蛋白和其他NiR蛋白的同源性做進(jìn)一步分析。用Clustalx軟件將NiR的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，然后將生成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)做N-J聚類(lèi)分析（見(jiàn)圖3）。

NiR進(jìn)化樹(shù)分析表明，甜菜與藜科植物NiR親緣關(guān)系較近，與其他植物存在一定差別。在該進(jìn)化樹(shù)中同科植物表現(xiàn)比較近的親緣關(guān)系，如豆科的大豆（Glycine max）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、百脈根（Lotus japonicus）、茄科的煙草（Nicotiana tabacum）、甜椒（Capsicum annuum）、喬木科的小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）。推測(cè)NiR在進(jìn)化過(guò)程中的變異不大，有較強(qiáng)的保守性。使用在線軟件Pfam分析NiR蛋白的保守序列，結(jié)果表明，NiR序列在133～598位氨基酸之間保守性很強(qiáng)。

圖3 甜菜NiR蛋白的分子進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic analysis of sugar beet NiR proteins

2.3.2 甜菜NiR基因編碼蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

甜菜NiR cDNA序列通過(guò)ORF finder分析，可得到完整的ORF位于核酸序列的32～1 831區(qū)域，編碼蛋白包含599個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為66.88 ku（Expasy protparam），理論等電點(diǎn)為7.21。酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）78個(gè)，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）78個(gè)。分子式為C2938H4716N848O873S31，總原子數(shù)為9 406。根據(jù)所編碼蛋白質(zhì)的一級(jí)序列進(jìn)行疏水性作圖（見(jiàn)圖4），疏水性較高的肽段處于蛋白質(zhì)內(nèi)部，反之，親水性較高的肽段處于蛋白質(zhì)分子的表面。

甜菜NiR的平均疏水性分析顯示約有10個(gè)峰值，表明該肽段約有10個(gè)疏水區(qū)域。使用在線分析軟件SignalP對(duì)甜菜NiR進(jìn)行信號(hào)肽的分析，得知甜菜NiR無(wú)典型的信號(hào)肽分值，無(wú)信號(hào)肽，為非分泌型蛋白。

圖4 甜菜NiR編碼蛋白的疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity profile of sugar beet NiR

2.3.3 甜菜NiR基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用ExPASy的GOR進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（見(jiàn)圖5），h代表α螺旋，e代表延伸鏈，c代表無(wú)規(guī)則卷曲。α螺旋、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲分別占29.05%、21.04%和49.92%。

2.3.4 甜菜NiR基因編碼蛋白立體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將所推測(cè)的甜菜NiR蛋白序列提交至ExPASy Geno3d，選取程序搜索到的第一個(gè)模板，以這一蛋白結(jié)構(gòu)作為模板進(jìn)行Geno3d建模。Geno3d建模如圖6所示，其中包括24個(gè)α螺旋和57個(gè)轉(zhuǎn)角。

圖5 GOR法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structures of protein predicted by GOR method

圖6 用Geno3d預(yù)測(cè)的甜菜NiR三維結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure of NiR protein predicted by Geno3d

3 討論

硝態(tài)氮（NO3-）是旱田作物可利用氮素的主要形式，NR是NO3-無(wú)機(jī)同化的限速酶，NiR是NO3-無(wú)機(jī)同化的控制酶。二者偶聯(lián)完成NO3-的無(wú)機(jī)同化。與NR相比較，有關(guān)NiR研究尚少。本研究首次克隆了甜菜亞硝酸還原酶基因，有助于后續(xù)研究NiR與NR的偶聯(lián)調(diào)節(jié)，及偶聯(lián)作用下與甜菜蔗糖代謝積累的相互關(guān)系，可為種質(zhì)資源鑒定、基因操作培育氮高效利用品種提供分子生物學(xué)理論依據(jù)；可從分子水平上闡明外界因子的調(diào)節(jié)作用，提高氮的轉(zhuǎn)化效率，為制定施肥措施服務(wù)；同時(shí)對(duì)防止與改善農(nóng)業(yè)施肥中硝酸鹽及其轉(zhuǎn)化過(guò)程中給地下水帶來(lái)的嚴(yán)重污染具有重要科學(xué)意義。

4 結(jié)論

本研究以甜菜甜研7號(hào)為材料，通過(guò)簡(jiǎn)并PCR和RACE方法克隆了甜菜亞硝酸還原酶cDNA和gDNA基因；利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行NiR基因的結(jié)構(gòu)及其理化特化分析。得到結(jié)論如下：

a.從甜菜中獲得了NiR基因mRNA和gDNA序列，其中mRNA序列長(zhǎng)度為2 014 bp（登陸號(hào)：HQ224499），可編碼一個(gè)含有599個(gè)氨基酸，gDNA序列長(zhǎng)度為2 815 bp（登陸號(hào)：HQ419065），包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。

b.分析了NiR的理化特征，得到NiR的理論等電點(diǎn)為7.21，分子式為C2938H4716N848O873S31，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為66.88 ku，對(duì)NiR進(jìn)行疏水性分析，顯示該肽段有約10個(gè)疏水區(qū)域。

c.二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NiR的α螺旋、延伸鏈、無(wú)規(guī)則卷曲分別占33.89%、12.85%和53.26%。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，NiR蛋白包括24個(gè)α螺旋和57個(gè)轉(zhuǎn)角。

d.構(gòu)建了NiR的進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明甜菜NiR與菠菜親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化中相對(duì)保守。運(yùn)用分析軟件Pfam分析甜菜NiR氨基酸序列，顯示甜菜NiR包含一個(gè)保守區(qū)域，存在于133～598位氨基酸之間。

e.運(yùn)用在線分析軟件SignalP對(duì)甜菜NiR進(jìn)行信號(hào)肽的分析，得知甜菜NiR無(wú)典型的信號(hào)肽分值，無(wú)信號(hào)肽，為非分泌型蛋白。

[1] 王玉琴.內(nèi)外生理?xiàng)l件下對(duì)小麥黃化幼苗葉片亞硝酸還原酶活力的影響[J].植物生理學(xué)通訊,1988(4):18-20.

[2] Takahashi M,Sasaki Y,Shoji I,et al.Nitrite reductase gene enrichment improves assimilation of NO2-inArabidopsis[J].Plant Physiology,2001,126:731-741.

[3] Faure J D,Vincentz M,Kronenberger J,et al.Co-regulated expression of nitrate and nitrite reductase[J].Plant J,1991(1):107-113.

[4] Lahners K,Kramer V,Back E,et al.Molecular cloning of complementary DNA encoding maize nitrite reductase[J].Plant Physiol,1988,88:741-746.

[5] Back E.Isolation of the spinach nitrite reductase gene promoter which confers nitrate inducibillity onGUSgene ecpression in transgenic tobacco[J].Plant Mol Biol,1991,17:9-18.

[6] Polcyn W,Lucinski R.Effect of N oxyanions on anaerobic induction of nitrite reductase in subcellular fraction ofBradyrhizobiumsp.(Lupinus)[J].Antonie van Leeuwenhoek,2009,95:159-164.

[7] Dose M M,Hirasawa M,Kleis-SanFrancisco S,et al.The ferredoxin-binding site of ferredoxin nitrite oxidoreductase differential chemical modification of the free enzyme and its comlex with ferredoxin[J].Plant Physiol,1997,114(3):1047-1053.

[8] 孫嘯,陸祖宏.生物信息學(xué)基礎(chǔ)[M].北京:清華大學(xué)出版社,2005.

[9] 鐘揚(yáng),王莉,張亮.生物信息學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2003.

[10] 張成崗,賀福初.生物信息學(xué)方法與實(shí)踐[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

[11] Baldi P,Chauvin Y,Hunkapiller T,et al.Hidden Markov models of biological primary sequence information[J].Proc Nat Acad Sci,1991(3):1059-1063,1994.