楊玉紅，劉 芳，康宗利，段玉璽

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護博士后流動站，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 供試菌株

沈陽棋盤山野生的蛹蟲草菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯 100 g、葡萄糖 10 g、牛肉膏 5 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.25 g、瓊脂 10 g，加蒸餾水至500 mL，煮沸使瓊脂完全融化，高壓蒸汽滅菌121℃，30 min。

1.1.3 試劑

75%酒精，無菌水。

1.1.4 主要儀器

手提式壓力蒸汽滅菌鍋、分析天平、超凈工作臺、HPX-9082MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，其他常用玻璃儀器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同的組織部位分離方法比較

（1）子實體分離法

在超凈工作臺上將蟲草子實體用75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗3次，再用小刀分別切取子實體頂端、中部、根部，然后接種到斜面培養(yǎng)基上，18℃恒溫培養(yǎng)15 d。觀察不同組織部位對北蟲草萌發(fā)天數(shù)、長勢、滿管時間的影響[1]。

（2）孢子分離法

上述方法洗滌得到的子實體，用小刀切取尖端，懸掛在三角瓶棉塞下端的不銹鋼彎鉤上，通過懸掛蟲草子實體，使頂端朝下，散落下來的孢子落在培養(yǎng)基上，從而繼續(xù)生長，并產(chǎn)生白色菌絲。在培養(yǎng)的前期，要保證室溫不能過高，因此本試驗在培養(yǎng)時，將三角瓶置于充滿涼水的盆中，并需要每天換水，維持較低的水溫。在18℃恒溫培養(yǎng)5 d后，無菌條件下取出子實體尖端，將三角瓶放回，繼續(xù)培養(yǎng)10 d[2]。

1.2.2 不同的消毒方式比較

以子實體頂端為例，處理方法見表1。

表1 不同的消毒方式

接種到斜面培養(yǎng)基上，18℃恒溫培養(yǎng)15 d。觀察不同消毒方式對北蟲草萌發(fā)天數(shù)、長勢、滿管時間的影響。

1.2.3 繼代培養(yǎng)試驗

挑選長勢好的分離菌種，接種到玻璃瓶中，將玻璃瓶放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織分離法分離北蟲草菌種的研究

2.1.1 不同組織部位對北蟲草萌發(fā)天數(shù)的影響

通過對同一株北蟲草分別切取頂端、中端和根部，采用相同的消毒方式進行除菌?？梢钥闯?，在培養(yǎng)的最初階段，在培養(yǎng)頂端和中端部位的試管中，北蟲草兩端均有白色菌絲生長，而在培養(yǎng)根部部位的試管中，沒有白色菌絲生長 （圖 1）。

2.1.2 不同組織部位對北蟲草長勢的影響

匍匐型菌絲的有無可作為判定菌種優(yōu)劣的依據(jù)，其量越多，菌種質(zhì)量越優(yōu)[3]。隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，在培養(yǎng)3種不同北蟲草部位的試管中，均產(chǎn)生了白色菌絲，長勢上并沒有出現(xiàn)差異。

2.1.3 不同組織部位對滿管時間的影響

經(jīng)過若干天的培養(yǎng)，3種不同部位的北蟲草菌絲體并未出現(xiàn)明顯的滿管現(xiàn)象。

2.1.4 孢子分離法分離北蟲草菌種的研究

孢子分離法培養(yǎng)前期如圖2-A，培養(yǎng)2 d后，培養(yǎng)基上已有少量的菌絲生成（圖2-B），培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)基上已經(jīng)形成了大量的菌絲（圖2-C）。此時，在無菌條件下取出子實體，繼續(xù)培養(yǎng)10 d。

從萌發(fā)時間和長勢上看，孢子分離法分離得到的菌株品質(zhì)更優(yōu)。

2.2 不同消毒方式的影響

2.2.1 不同消毒方式對北蟲草萌發(fā)天數(shù)的影響

北蟲草子實體本身就具有一定的抑菌能力[4]，即便未用酒精進行消毒處理，在菌絲體的兩端也有菌絲生成，并且未經(jīng)過酒精處理的菌絲體（1號、2號）萌發(fā)較早、較旺盛。

2.2.2 不同消毒方式對北蟲草長勢的影響

未經(jīng)過酒精處理的2組長勢較好，并且有明顯的匍匐狀菌絲出現(xiàn)。而經(jīng)過酒精處理過的3組長勢一般，其中后2組還有未出現(xiàn)菌絲的情況發(fā)生，出現(xiàn)這種狀況的原因可能是由于在使用酒精消毒的過程中，浸泡時間過長，使菌絲體活性喪失。

2.2.3 不同消毒方式對北蟲草滿管時間的影響

未經(jīng)過酒精消毒的2組（1號、2號）北蟲草菌絲體，在培養(yǎng)8 d后，菌絲體長滿了整個試管，而其余幾組則沒有滿管的現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.3 繼代培養(yǎng)驗證

孢子分離法分離得到的菌株，經(jīng)繼代培養(yǎng)得到的蟲草子實體（圖3），色澤和產(chǎn)量都很好，這驗證了孢子分離法分離得到的菌株品質(zhì)更優(yōu)這一結(jié)論。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過實驗可得出，第一，子實體靠近頂端分離的菌種易于萌發(fā)，孢子分離得到的菌種品質(zhì)更優(yōu)；第二，北蟲草子實體本身就具有抑菌作用，因此，在選取表面消毒方式時，一定要適宜，不可時間過長，以免對子實體造成傷害，不產(chǎn)生菌絲。

3.2 討論

目前國內(nèi)有關(guān)北蟲草的研究很多，但多為分類、品種資源分布方面的工作，栽培生產(chǎn)方面的研究報道尚少，對此菌的生物學(xué)特性、遺傳特性等尚未盡悉搞清。在組織分離獲取菌種的實驗中發(fā)現(xiàn)，在子實體有龜背狀花紋的頂端切取組織，獲得的菌種種性優(yōu)，產(chǎn)量高。北蟲草菌種轉(zhuǎn)管次數(shù)增多，子實體產(chǎn)量下降，生產(chǎn)上菌種轉(zhuǎn)管次數(shù)不宜超過3次。

[1]柯傳奎.中國冬蟲夏草研究[M].中國科學(xué)技術(shù)出版社，2005.

[2]包天桐.冬蟲夏草的開發(fā)于應(yīng)用[J].中草藥，1983，14(5)：32-34.

[3]陳艷秋，樸日子，金英善，等.北蟲草人工優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)研究[J].中國食用菌，2002，21 (5)：20-22.

[4]陳順志.蛹草瓶栽技術(shù)簡介[J].食用菌，1990，12(4)：31.