易先國，雷咸波，何書海，孫 偉，劉漢儒

（1.信陽農業(yè)高等?？茖W校動物科學系，河南 信陽 464000；2.河南省信陽市光山縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 信陽 464000；3.西南大學藥學院，重慶 北碚 400700）

畜禽免疫抑制性疾病是集約化養(yǎng)殖業(yè)所面臨的嚴峻問題，嚴重制約我國畜牧業(yè)的發(fā)展。大量文獻資料表明，部分中藥可調整和明顯增強機體免疫功能，使參與細胞免疫的細胞數(shù)量增加、活性增強，使參與體液免疫的抗體增加［1］。

紫芪顆粒由紫錐菊、黃芪組成，具有免疫增強及抗病毒的作用［2-3］。本試驗采用氫化可的松制造免疫抑制小鼠病理模型，再分組灌胃給藥不同劑量的紫芪顆粒溶液，探討其對免疫抑制小鼠免疫功能的影響，為紫芪顆粒治療畜禽免疫抑制性疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 體重為20g±2g小鼠，雌雄各半，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供。

1.2 主要藥品與儀器 藥品：紫芪顆粒（西南大學藥學院自制，批號：20091127）；氫化可的松注射液（西南藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H50021209，規(guī)格：5mL，含量：25mg）。新生牛血清（FCS）（杭州新銳生物工程有限公司，批號：20080302），小鼠淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）。儀器：AC85-268攝影顯微鏡及配套相機（重慶光學儀器廠），GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司），755B紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.3 主要溶液的配制 無Ca2+、Mg2+Hank′s液：8.00g NaCl、0.35g NaHCO3、0.40g KCl、0.06g Na2HPO4·12H2O、0.06g KH2PO4加 H2O 至1000.00mL，用5.6%NaHCO3調pH值至7.2，115℃滅菌15min。4℃貯藏備用。

5.6 %NaHCO3液：5.60g NaHCO3，加蒸餾水100.00mL，115℃20min滅菌，4℃貯藏備用。

Alserver′s溶液：二水枸櫞酸鈉8.0g、枸櫞酸0.5g、葡萄糖20.5g、氯化鈉4.2g加蒸餾水至1000mL、過濾，分裝，10磅高壓20min，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

新生牛血清（FCS）：杭州新銳生物工程有限公司，批號：20080302，購得的新生牛血清先經(jīng)過56℃，30min滅活后使用。

1.4 試驗動物分組及造模 本試驗共分為6組，每組10只小鼠，分為正常生理鹽水對照組（A）、正常紫芪顆粒藥物對照組（B）、免疫抑制模型對照組（C）、紫芪顆粒低劑量組（D）、紫芪顆粒中劑量組（E）和紫芪顆粒高劑量組（F），見表1。

表1 試驗動物分組及處理

免疫抑制小鼠模型的建立：氫化可的松免疫抑制小鼠，所用的氫化可的松劑量為75μg／g體重。一般而言，糖皮質激素的抗炎劑量是體內生理濃度的10倍，免疫抑制的劑量應為抗炎劑量的2倍［4］。

1.5 給藥劑量和給藥時間的確定 根據(jù)《新藥臨床前安全性評價與實踐》（袁伯俊主編，軍事醫(yī)學科學出版社），通用公式logS=0.8762+0.698logW（S：體表面積；W：體重）［5-7］，換算成小鼠劑量為0.026 g／d。具體各組用藥劑量、次數(shù)如下：生理鹽水對照組給0.05mL／只·次·d生理鹽水；紫芪顆粒低劑量組給0.05mL／只·次·d濃度為0.5g／mL紫芪顆粒溶液；紫芪顆粒中劑量組給0.1mL／只·次·d濃度為0.5g／mL紫芪顆粒溶液；紫芪顆粒高劑量組給0.15mL／只·次·d濃度為0.5g／mL紫芪顆粒溶液。

各抑制組在灌胃給藥的第11天皮下注射氫化可的松0.4mL／只·次，隔日1次，共5次，繼續(xù)給藥喂養(yǎng)10d，測定各個指標。

1.6 觀察指標與方法 （1）腹腔巨噬細胞吞功能測定 基本按文獻［8］方法進行。（2）小鼠外周血淋巴細胞分離及花環(huán)形成試驗：基本按文獻［9，10］方法進行。（3）血清溶血素測定：基本按文獻［11］方法進行。（4）脾腺指數(shù)測定：按文獻［11］方法進行。

1.7 數(shù)據(jù)處理SPSS分析軟件處理。

2 結果與分析

測定結果，見表2。

表2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能、E-玫瑰花環(huán)形成率、血清溶血素、脾臟指數(shù)測定結果 （）

表2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能、E-玫瑰花環(huán)形成率、血清溶血素、脾臟指數(shù)測定結果 （）

注：與生理鹽水比較，＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01；與紫芪顆粒+生理鹽水組比較，△：P＜0.05，△△：P＜0.01；與生理鹽水+氫化可的松組比較，＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01

通過SPSS分析可知，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率：免疫低下模型組與生理鹽水組之間差異極顯著（P＜0.01），表明用氫化可的松造免疫低下小鼠模型有意義；紫芪顆粒正常藥物對照組與生理鹽水組之間差異極顯著（P＜0.01），紫芪顆粒低、中劑量治療組與免疫低下模型對照組之間差異極顯著（P＜0.01），而與正常生理鹽水對照組之間無顯著性差異，表明紫芪顆粒低、中劑量能顯著的增強免疫低下小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能，使其達到正常生理水平，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)之間各組差異性不大，紫芪顆粒正常藥物組的吞噬指數(shù)最高，表明紫芪顆粒能增強正常小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能。

淋巴細胞E-玫瑰花環(huán)形成率：免疫低下模型對照組與生理鹽水對照組之間差異顯著（P＜0.05），表明氫化可的松造模有意義；紫芪顆粒正常對照組與生理鹽水對照組之間差異極顯著（P＜0.01），表明紫芪顆粒能明顯提高正常小鼠淋巴細胞的免疫功能，紫芪顆粒低、中、高劑量抑制組與正常生理鹽水對照組之間均無顯著性差異，表明紫芪顆粒均能增強免疫抑制小鼠淋巴細胞功能，使其達到正常生理水平。

小鼠血清溶血素生成量：紫芪顆粒正常對照組與生理鹽水對照組之間有極顯著性差異（P＜0.01），表明紫芪顆粒能極顯著的提高正常小鼠血清溶血素量；紫芪顆粒低、中、高劑量組與生理鹽水對照組之間均有極顯著性差異（P＜0.01），表明紫芪顆粒能極顯著的提高免疫低下小鼠血清溶血素量，能使免疫低下小鼠的血清溶血素量高于正常組。

小鼠脾臟功能：免疫低下模型對照組與生理鹽水對照組之間差異顯著（P＜0.05），表明用氫化可的松造模有意義；紫芪顆粒正常對照組與生理鹽水對照組之間差異極顯著（P＜0.01），表明紫芪顆粒能極顯著的增加正常小鼠的脾臟重；紫芪顆粒低劑量組與生理鹽水對照組之間差異不顯著，與免疫低下模型對照組之間有顯著性差異（P＜0.05），表明紫芪顆粒低劑量能提高免疫抑制小鼠脾臟功能達到正常生理水平；紫芪顆粒中、高劑量組與生理鹽水對照組之間差異顯著（P＜0.05），與模型對照組之間差異不顯著，表明紫芪顆粒中、高劑量組在提高免疫抑制小鼠脾臟功能方面無明顯作用。

3 小結與討論

本文通過對免疫低下模型小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬百分率、淋巴細胞E-玫瑰花環(huán)形成率、血清溶血素生成量、鼠脾臟功能指標的測定顯示，免疫低下模型組與生理鹽水組之間差異極顯著（P＜0.01），表明氫化可的松能顯著的降低正常小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能，降低正常小鼠的淋巴細胞E-玫瑰花環(huán)形成率，降低正常小鼠的血清溶血素生成量和降低正常小鼠的脾臟功能，證明了本試驗成功的用氫化可的松制造免疫低下小鼠模型。

通過對紫芪顆粒正常藥物對照組與生理鹽水組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬百分率、淋巴細胞E-玫瑰花環(huán)形成率、血清溶血素生成量、鼠脾臟功能指標的測定顯示，紫芪顆粒正常藥物對照組與生理鹽水組之間各個指標差異都極顯著（P＜0.01），表明紫芪顆粒能顯著的增強正常小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，能明顯提高正常小鼠淋巴細胞的免疫功能，能極顯著的提高正常小鼠血清溶血素生成量，能極顯著的增加正常小鼠的脾臟重，證實了紫芪顆粒能明顯的提高正常小鼠的免疫功能。

［1］黃一帆.天然藥物免疫促進劑和調節(jié)劑開發(fā)應用研究展望［J］.福建畜牧獸醫(yī)，1999（1）：37-38.

［2］吳江濤，劉珂.紫錐菊提取物對小鼠單核巨噬細胞系統(tǒng)功能的影響［J］.煙臺大學學報：自然科學與工程版，2001，14（2）：131-134.

［3］VINTI G，CHUCK C，JAN V，et al.Alkylamides of Echinacea purpurea stimulate alveolar macmphage function in normal rats［J］.International Immunopharmacology，2002，2（3）：381-387.

［4］陳杖榴.獸醫(yī)藥理學［M］.2版.北京：中國農業(yè)出版社，2002：152.

［5］黃芳華.中藥新藥申報資料中劑量問題探討［J］.中藥研究與信息，2004，6（11）：26-28.

［6］李建榮，黃芳華.中藥新藥長期毒性試驗設計及常見問題分析［J］.中國新藥雜志，2004，13（9）：769-762.

［7］向楠，鄧阿黎，鄧蘭瓊，等.中藥新藥臨床試驗對照藥選擇的問題與對策［J］.中國臨床藥理學與治療學，2005，10（5）：598-560.

［8］徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗學方法［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：936.

［9］劉玉斌，茍仕金.動物免疫學實驗技術［M］.長春：吉林科學技術出版社，1980：234.

［10］吳鐵，郭澄泓.用PHA在小鼠體內誘發(fā)淋巴細胞轉化的初步觀察［J］.上海免疫學雜志，1984，4（1）：57.

［11］中國藥理學會.藥理學進展-抗炎免疫藥理分冊 ［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1983：208-214.