葉麗卡，謝志紅，陳瑞卿（廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣州 510260）

5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是尿嘧啶的類(lèi)似物，可以使合成脫氧核糖核酸（DNA）的胸腺嘧啶合成酶失活，也可直接替代尿嘧啶摻入核糖核酸（RNA），導(dǎo)致致死合成。因此，在消化道、頭頸部腫瘤等多種惡性腫瘤的治療中，5-FU是最常用的基礎(chǔ)藥物[1，2]。5-FU在體內(nèi)代謝半衰期短、毒副反應(yīng)大，且吸收不規(guī)則、個(gè)體消除呈非線性，若體內(nèi)濃度過(guò)高時(shí)會(huì)發(fā)生典型的毒副反應(yīng)如胃腸道毒性和骨髓抑制，還會(huì)在生長(zhǎng)迅速的正常組織中產(chǎn)生一些毒性作用，包括中樞系統(tǒng)（如小腦變性、共濟(jì)失調(diào)、嗜睡）、心血管系統(tǒng)及皮膚（如手足綜合征、感覺(jué)遲鈍）等毒性作用。因此，有必要建立測(cè)定人體血漿5-FU濃度水平的方法用于藥動(dòng)學(xué)以及相關(guān)研究。眾多文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜（HPLC）法成功測(cè)定5-FU前體類(lèi)藥物在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、直腸癌的癌組織、血液、正常組織中不同時(shí)間點(diǎn)的濃度變化[3～6]，但方法往往檢測(cè)限過(guò)高或者難以重復(fù)。本試驗(yàn)旨在建立一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定人體血漿內(nèi)5-FU血藥濃度的方法，為下一步研究該藥在我國(guó)人群的藥動(dòng)學(xué)打下基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括LC-10ATVP雙泵、SPD-M10AVP可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、CTO-10AVP柱溫箱、SIL-10ADVP自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-10A系統(tǒng)控制器、DGU-12A脫氣裝置、LC solution工作站（日本島津公司）；XW-80渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；B160A型醫(yī)用低速離心機(jī)（河北白洋離心機(jī)廠）；5417R小型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；真空離心濃縮儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 試藥

5-FU對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：097K1352，純度：99%）；其余試劑均為分析純；所用超純水為自制去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate C18色譜柱（250mm×4.5mm，5μm）；流動(dòng)相：10mmol·L－1KH2PO4溶液；流速：1.0m L·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對(duì)照品溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取5-FU對(duì)照品30.7mg至25m L量瓶，加入1m L鹽酸，最后用蒸餾水定容至刻度，得到1.228mg·m L－1的5-FU對(duì)照品溶液。

2.3 血漿樣品處理方法

取血漿100μL，置于5m L玻璃試管中，加入乙酸乙酯2 m L，渦旋振蕩2min后，3 200 r·min－1離心5min，取上層析液置于另一玻璃試管中；再次加入乙酸乙酯2m L進(jìn)行第2次提取，渦旋振蕩2min后，3 200 r·min－1離心5min，取上層析液。合并2次提取的上層析液，離心濃縮揮干，加入100μL流動(dòng)相，混勻取出，置于EP管中，10 000 r·min－1離心7min，取上清液20μL進(jìn)樣。

2.4 專(zhuān)屬性考察

將取空白血漿200μL按“2.3”項(xiàng)下方法操作，取上清液20 μL進(jìn)樣分析，得到空白血漿色譜圖，判斷空白血漿的干擾情況；取5-FU對(duì)照品20μL進(jìn)樣分析，得到5-FU對(duì)照品色譜圖，判斷5-FU在本文方法條件下出峰情況；將空白血漿和5-FU對(duì)照品混合，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，取上清液20μL進(jìn)樣分析，得血漿+5-FU對(duì)照品色譜圖。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.5-FU對(duì)照品；B.空白血漿+5-FU對(duì)照品；C.空白血漿；1.5-FUFig 1 HPLC chromatogram sA.5-FU control；B.blank plasma+5-FU control；C.blank plasma；1.5-FU

2.5 線性關(guān)系考察

取空白血漿8份，分別加入由5-FU對(duì)照品和蒸餾水配制的系列標(biāo)準(zhǔn)液適量并混勻，使血漿中藥物濃度分別為0.48、0.96、1.92、3.84、7.68、15.35、30.7、61.4μg·m L－1，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，最后分別取20μL進(jìn)樣，經(jīng)HPLC法分析，得到5-FU各濃度峰面積（A）。以峰面積（A）對(duì)相應(yīng)濃度（c）進(jìn)行回歸分析，得到5-FU的回歸方程為A＝0.542 2c－0.091 8（r＝0.999 8，n＝8）。結(jié)果表明，5-FU血藥濃度在0.48～61.4μg·m L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度及回收率試驗(yàn)

配制5-FU低、中、高（1.92、7.68、30.7μg·m L－1）3種不同濃度的含藥標(biāo)準(zhǔn)血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度進(jìn)行5樣本分析，于同日內(nèi)和連續(xù)3 d內(nèi)分別處理測(cè)定。將測(cè)得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得相應(yīng)濃度，計(jì)算RSD；與理論濃度相比，求得方法回收率，詳見(jiàn)表1。

表1 精密度及方法回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Resultsof precision andmethodology recovery tests

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制含5-FU 1.92、7.68、30.1mg·L－1的3組共15個(gè)樣品，分別考察室溫放置（1、2、3 d）穩(wěn)定性、長(zhǎng)期凍存（－20℃凍存10、20、30 d）以及凍融穩(wěn)定性（凍融1、2、3次），按“2.3”項(xiàng)下方法分別進(jìn)行操作及測(cè)定，結(jié)果其RSD均＜10%。

2.8 樣品質(zhì)量控制試驗(yàn)

分別配制成低、中、高濃度（1.92、7.68、30.1mg·L－1）的血漿樣品各12份，置－20℃凍存?zhèn)溆?。每次檢測(cè)血樣時(shí)同時(shí)檢測(cè)3種質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品，如果相對(duì)回收率落在85%～115%之間，即可認(rèn)為檢測(cè)正常，否則須檢查整個(gè)操作過(guò)程以及儀器原因。在本試驗(yàn)中，檢測(cè)的質(zhì)控樣品均在規(guī)定范圍內(nèi)，則可認(rèn)為儀器處于正常狀態(tài)。

3 討論

5-FU水溶性很大，在本研究建立的方法中，筆者用純磷酸鹽作為流動(dòng)相，流動(dòng)相中不含有機(jī)溶劑，容易長(zhǎng)菌變質(zhì)，因此，要注意即時(shí)沖洗管道，以免造成污染和堵塞；同時(shí)，應(yīng)注意選用適用于水溶性物質(zhì)的色譜柱，以免出現(xiàn)色譜柱壽命過(guò)短而造成損失和延誤試驗(yàn)進(jìn)程。

因?yàn)?-FU為水溶性較強(qiáng)的物質(zhì)，因此，在部分文獻(xiàn)中，采用了蛋白沉淀法處理血漿樣品。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，若用高氯酸、乙腈、甲醇等沉淀蛋白，在5-FU出峰時(shí)間均存在干擾，無(wú)法消除或與待測(cè)物質(zhì)分離；另外，蛋白沉淀法往往稀釋了藥物濃度，而5-FU在血漿中濃度較低，因此，用有機(jī)溶劑提取后濃縮更利于提高檢測(cè)靈敏度。筆者曾嘗試用二氯甲烷、異丙醇、氯仿、乙酸乙酯等作為提取溶劑，經(jīng)比較，乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，提取率最好、干擾少。因此，選用乙酸乙酯作提取溶劑。

經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法符合生物樣本測(cè)定的要求，與文獻(xiàn)報(bào)道的5-FU測(cè)定方法相比，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中所用試劑成本低，適合大樣本研究中血漿中5-FU濃度的測(cè)定。該方法具有操作簡(jiǎn)便可靠、準(zhǔn)確、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，適用于人血漿中5-FU的濃度測(cè)定。該方法的建立可以為5-FU的人體藥動(dòng)學(xué)相關(guān)研究提供參考。

[1]黎遠(yuǎn)冬，梁寧生，韋勁松，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定人血漿中5-氟尿嘧啶及其活性代謝物5-氟-2脫氧尿嘧啶核苷的濃度[J].藥物分析雜志，2007，27（4）：494.

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