劉永勝，陳華，金偉華，范敏（.成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，成都60083；.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，成都60083）

抗病毒口服液[1]是我科根據(jù)《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》研制的中藥制劑，由山豆根、魚腥草、板藍(lán)根、青蒿、白芷、忍冬藤等組成。臨床上主要用于治療病毒性感冒，療效確切。山豆根是該口服液的主藥，來源于豆科植物越南槐（Sophora tonkinens Gapnep）的干燥根及根莖，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，用于火毒蘊(yùn)結(jié)、咽喉腫痛、齒齦腫痛的治療，為常用中藥，其主要化學(xué)成分為生物堿、黃酮和多糖等物質(zhì)，其中生物堿在醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用。苦參堿是山豆根的主要成分，具有多種藥理活性。為更好控制該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量和提高其藥品標(biāo)準(zhǔn)水平，筆者對(duì)其中的主要成分苦參堿含量測定方法進(jìn)行了試驗(yàn)研究。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜（HPLC）儀，包括四元泵、可變波長檢測器、Agilent 1200型化學(xué)工作站（美國安捷倫公司）；DU 730型紫外-可見分光光度計(jì)（美國貝克曼公司）；AL 204型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）；AP-01P型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器公司）；SZ-97型自動(dòng)三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

抗病毒口服液（成都軍區(qū)總醫(yī)院自制，10 mL/支×10瓶/盒，批號(hào)：110321A、110321B、110321C）；苦參堿對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110805-200507）；水為三重蒸餾水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，V/V＝25∶75）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按苦參堿計(jì)算不得低于2 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥至恒重的苦參堿對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成苦參堿對(duì)照品貯備液（0.90 mg·mL－1），再精密量取適量，制成每1 mL含苦參堿0.09 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取抗病毒口服液20 mL，置于分液漏斗中，精密加入三氯甲烷20 mL，濃氨試液0.5 mL，搖勻，靜置至溶液分層，取下層液體，再重復(fù)上述操作2次。合并下層液體，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，40℃揮干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例配成缺山豆根藥材的陰性樣品，照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，取陰性對(duì)照液20 mL，置于分液漏斗中，用三氯甲烷萃取，過濾，干燥，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入HPLC儀測定，色譜見圖1。結(jié)果，陰性對(duì)照溶液在與苦參堿對(duì)照品溶液相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間位置上未見吸收峰，說明陰性對(duì)照溶液無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.陰性對(duì)照；C.供試品；1.苦參堿Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.negative sample；C.sample；1.martine

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取苦參堿對(duì)照品貯備液（0.90 mg·mL－1）適量，加甲醇稀釋制成濃度0.18、0.09、0.036、0.018、0.009 mg·mL－1的溶液。分別精密吸取10 μL，注入HPLC儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件記錄色譜圖。以苦參堿檢測濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y＝28 120X+64.207（r＝0.999 6）。結(jié)果表明，苦參堿檢測濃度在0.009～0.18 mg·mL－1濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為0.090 mg·mL－1的對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定苦參堿峰面積。結(jié)果，苦參堿對(duì)照品峰面積RSD＝1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、6、8、10 h分別進(jìn)樣測定其峰面積。結(jié)果，苦參堿峰面積RSD＝1.47%（n＝3），表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品適量，精密稱取6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)平行測定。結(jié)果，苦參堿平均含量為0.011 mg·mL－1，RSD＝1.68%（n＝6），表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)（批號(hào)：101012，含量：0.115 3 mg）樣品約10 mL，各6份，在苦參堿線性關(guān)系的濃度范圍內(nèi)，按供試樣品苦參堿原有含量約1∶1的比例，分別加入苦參堿對(duì)照品0.090 mg，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定苦參堿含量，并計(jì)算各自加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品含量測定

精密稱取3批供試品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試液，分別測定其苦參堿含量。結(jié)果，3個(gè)批號(hào)的供試品苦參堿含量分別為 0.011 53、0.011 89、0.011 75 mg·mL－1，RSD＝1.32%，表明供試樣品苦參堿含量穩(wěn)定，樣品生產(chǎn)工藝成熟、穩(wěn)定、可靠。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

3 討論

3.1 色譜柱選擇[2，3]

對(duì)于生物堿的HPLC法分析，通常采用離子對(duì)色譜，但平衡時(shí)間較長，不利于快速分析。2005年版《中國藥典》中采用氨基柱，能同時(shí)分析苦參堿和氧化苦參堿，但氨基柱不常用，且穩(wěn)定性稍差。因此，筆者選擇了實(shí)驗(yàn)室常用的耐高pH的C18柱。

3.2 測定波長選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)資料[4，5]和苦參堿的理化性質(zhì)對(duì)檢測波長進(jìn)行選擇，取苦參堿對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果在205～207 nm波長處苦參堿有較強(qiáng)的吸收，最大吸收波長為206.8 nm，但是206.8 nm波長靠近紫外末端吸收區(qū)，干擾較大，影響苦參堿的含量測定。經(jīng)驗(yàn)證210 nm波長比較合適，干擾小且靈敏度高，吸收度能達(dá)到最大吸收波長206.8 nm的98.5%，故將苦參堿含量測定的檢測波長定為210 nm。

3.3 流動(dòng)相的選擇

筆者曾采用甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很難檢出苦參堿，而采用甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)，樣品中其他雜質(zhì)與苦參堿未分離，最后用乙腈-磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）可使苦參堿與樣品雜質(zhì)分開，且峰形較好。因此，選擇該系統(tǒng)為流動(dòng)相。

3.4 方法的選擇

2010年版《中國藥典》[6]載有抗病毒口服液，采用的是對(duì)連翹苷進(jìn)行定量測定，而本制劑因處方與藥典處方不同，故對(duì)苦參堿進(jìn)行含量測定。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于抗病毒口服液的質(zhì)量控制。

[1]陳延清，張永嵩，尤 建，等.抗病毒顆粒（無糖型）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國中藥雜志，2000，25（4）：218.

[2]王 苑，曾榮仕，朱湛華.RP-HPLC法測定苦參中苦參堿的含量[J].中國藥房，2007，18（27）：2 124.

[3]夏學(xué)勵(lì).HPLC法測定癬凈顆粒中苦參堿、氧化苦參堿的含量[J].中國藥房，2009，20（18）：1 420.

[4]葉秀金，宋粉云.HPLC法測定清肺抑火丸中苦參堿和氧化苦參堿含量[J].中國藥房，2011，22（12）：1 127.

[5]佘志華，文曉柯，吳雅麗.高效液相色譜法測定陰炎凈中苦參堿的含量[J].中南藥學(xué)，2008，6（5）：559.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：758.