童永清 鄭紅云 李 鋒 顧 劍 李 艷，＃

童永清1，2，鄭紅云2，李 鋒2，顧 劍1，李 艷1，2，＊

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060，1檢驗科； 2臨床分子診斷中心； ＊通訊作者

酪氨酸激酶JAK2（Janus Tyr osine Kinase 2，JAK2）為非受體型即細(xì)胞內(nèi)激酶，是JAK2基因編碼的一種能調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的蛋白質(zhì)，與JAK1、JAK3和 TYK2同屬于JAK 家族［1］。研究發(fā)現(xiàn)，V617F突變位于JAK2的JH2假激酶區(qū)，該區(qū)域與JAK2活性的抑制有關(guān)。V617F突變時導(dǎo)致JAK2持續(xù)激活，從而導(dǎo)致不受控制的細(xì)胞持續(xù)增殖而引起骨髓細(xì)胞增多而導(dǎo)致骨髓增殖性疾?。∕yeloprolif erative Diseases，MPD）的發(fā)生［2，3］。

MPD包括真性紅細(xì)胞增多癥（PV）、特發(fā)性骨髓纖維化（IMF）、原發(fā)性血小板增多癥（ET）。WHO于2008年將JAK2基因V617F突變列為MPD的主要確診指標(biāo)之一［4］，同時JAK2基因V617F突變檢測也是監(jiān)測臨床治療療效的分子靶標(biāo)［5］。因此檢測或監(jiān)測 MPD患者JAK2基因V617F突變是十分重要的。本研究建立一種基于鎖核 酸 PCR（Locked Nucleic Acid PCR，LNA PCR）方法檢測JAK2基因 V617F突變，并探討其臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 樣品

收集2010年5月～2011年10月在本院血液科確診住院的68例MPD患者的EDTA抗凝外周血或骨髓標(biāo)本2～3 ml。患者平均年齡27.3±9.1歲，男43例，女25例。其中PV 37例、ET 22例、IMF 9例。以上患者均符合WHO骨髓增生異常／骨髓增生性疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.2 實驗試劑及儀器

人基因組DNA提取試劑盒（Bl ood ＆Cell Culture DNA Mini Kit）由凱杰生物技術(shù)有限公司（深圳）提供（貨號：13323）；DNA PCR擴(kuò)增試劑（2×Taq PCR Master Mix）由上海萊楓生物技術(shù)有限公司提供（貨號：PT102－02）；DNA 測序試劑盒（The Big Dye Ter minator v3.1 Cycle Sequencing Kit）由Life Technologies公司提供（貨號：4337456）；DNA Mar ker由上海萊楓生物技術(shù)有限公司提供（貨號：PM101－02）。ND－2000超微量核酸蛋白測定儀（美國Nano Drop公司生產(chǎn)）；9700 PCR擴(kuò)增儀（Life Technologies公司生產(chǎn)）；DNA凝膠電泳儀（北京六一儀器廠生產(chǎn)）；DNA測序儀（Life Technol ogies公司生產(chǎn)）；凝膠成像系統(tǒng)（法國VL公司生產(chǎn)）。

1.3 檢測方法

1.3.1 人基因組DNA提?。喝〔杉腗PD患者EDTA抗凝外周血或骨髓100μl，按照人基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取人基因組DNA，ND－2000超微量核酸蛋白測定儀測定A260／A280比值，分析提取基因組DNA純度，同時測定提取基因組DNA含量。所提基因組DNA放置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 JAK2基因V617F突變LNA PCR檢測引物及LNA設(shè)計：根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心提供的JAK2基因序列（NG＿009904.1）及 V617F突變所在的位置，設(shè)計引物擴(kuò)增的DNA片段包含V617F突變位點，同時設(shè)計與野生型V617 V結(jié)合的LNA。包含V617位點的JAK2基因擴(kuò)增上游引物5’－TCC TCA TCT ATA GTC ATG CTG AAA G－3’，下 游 引 物 5’－TCA GTT TCA AAA ATA CTT AAC TCC TG－3’，目的片段大小為348bp。封閉野生型V617 V位點的LNA為5’－CAC AGA CAC ATA C－3’（圖1）。當(dāng)JAK2基因V617位點為野生型時，LNA可以與其結(jié)合，阻止PCR擴(kuò)增，而當(dāng)JAK2基因V617位點為突變型時，則LNA不能與其結(jié)合，PCR可以有效擴(kuò)增。

圖1 JAK2基因V617位點引物及LNA設(shè)計示意圖

1.3.3 LNA PCR反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃3 min，然后95℃30s，60℃45s，72℃50s，共35個循環(huán)，最后72℃5 min。

1.3.4 LNA PCR檢測JAK2基因V617F突變靈敏度分析：分別取經(jīng)DNA測序確認(rèn)的JAK2基因V617F突變型與JAK2基因V617 V未突變型基因組DNA，用去離子水將DNA濃度調(diào)整至2μg／ml，將JAK2基因V617F突變型與JAK2基因V617 V未突變型基因組DNA按1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶200依次進(jìn)行混合，每一混合濃度分為加入LNA組和無LNA組，以JAK2基因V617 V未突變型基因組DNA（未加LNA）作為陽性對照，去離子水作為陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同前。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像并分析結(jié)果。

1.3.5 LNA PCR檢測JAK2基因V617F突變的敏感性及特異性比較：將JAK2基因V617F突變型與JAK2基因V617 V未突變型基因組DNA（同1.3.4中的樣品）按10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9和0∶10進(jìn)行混合，一組加入LNA序列，另一組直接用JAK2基因PCR引物（不加入LNA序列）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同前。PCR反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳，在紫外線下切膠回收后進(jìn)行測序分析。

1.3.6 LNA PCR檢測 MPD患者JAK2基因V617F突變：以人管家基因GAPDH為內(nèi)參照，PCR分別擴(kuò)增JAK2基因V617突變（加入引物和LNA）和GAPDH（加入引物）基因片段，其中GAPDH基因擴(kuò)增上游引物為5’－ACC AAC TGC TTA GCA CCC CT－3’，下游引物為5’－TAC TCC TTG GAG GCC ATG TG－3’，擴(kuò)增條件同前。反應(yīng)結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)成像分析產(chǎn)物大小。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。檢測數(shù)據(jù)采用百分比表示，線性結(jié)果采用擬合曲線。

2 結(jié) 果

2.1 LNA PCR檢測JAK2基因V617F突變的靈敏度

LAN PCR檢測結(jié)果顯示，當(dāng)JAK2基因V617F突變型與JAK2基因V617 V未突變型基因組混合比例達(dá)1∶100時，仍然可以檢測出JAK2基因V617F突變型。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖2。

2.2 LNA PCR檢測JAK2基因V617F突變的敏感性及特異性

測序結(jié)果顯示：加入LNA序列的一組除0∶10混合比例未檢測到JAK2基因片段，其余均檢測到JAK2基因V617F突變型純合子，表明LNA PCR法特異性好。而未加入LNA序列的一組中，盡管都可以擴(kuò)增出JAK2基因片段，且當(dāng)JAK2基因V617F突變型占混合比例高于20%時，通過測序可以檢測出JAK2基因V617F突變型（圖3A～3D箭頭所示），但當(dāng)JAK2基因V617F突變型低于混合比例的20%時，通過測序法無法檢測出JAK2基因V617F突變型的存在（圖3E、3F）。

圖2 PCR拉增產(chǎn)物電泳圖

2.3 LNA PCR檢測68例MPD患者JAK2基因的V617F突變

在68例MPD患者中，共檢測出JAK2基因V617F突變患者55例，檢出率80.88%。其中，在37例PV患者中，JAK2基因V617F突變比例為91.89%（34／37）；在22例 ET 患者中，JAK2基因V617F突變比例為68.18%（15／22）；在9例 MF患者中，JAK2基因V617F突變比例為66.67%（6／9）。

圖3 JAK2基因V617突變位點測序圖

3 討 論

LNA［6］是一種人工合成的反義寡核苷酸，是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物，結(jié)構(gòu)中含有一個或多個2’－O，4’－C－亞甲基－β－D－呋喃核糖核酸單體，其中核糖的2’－O位和4’－C位通過不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，并連接成環(huán)形，這個環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3’－內(nèi)型的N構(gòu)型，降低了核糖結(jié)構(gòu)的柔韌性，增加了磷酸鹽骨架局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，因此其對DNA、RNA有很好的識別能力和強(qiáng)大的親和力，與DNA、RNA互補的雙鏈有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，不易被酶降解，可應(yīng)用于PCR等技術(shù)中［7，8］。

本研究檢測JAK2基因V617F突變所采用的LNA PCR方法與已報道的檢測方法如限制性片段長度多態(tài)性分析［9］、高分辨溶解曲線［10］、等位基因特異性 PCR（AS－PCR）［11］、常規(guī)測序和實時定量PCR［12］等不同，其技術(shù)特點是通過LNA序列與JAK2基因V617野生型位點結(jié)合，從而阻滯PCR延伸，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。但LNA序列不能與JAK2基因V617F突變位點結(jié)合，故其PCR擴(kuò)增不受影響，因而能將突變型和野生型區(qū)分開來。本研究設(shè)計的LNA PCR檢測JAK2基因V617F突變型非常特異，PCR產(chǎn)物經(jīng)直接測序法驗證均為JAK2基因V617F突變型純合子。LNA PCR能從JAK2基因V617F突變型與JAK2基因V617 V未突變型混合比例為1∶100雜合子中檢測出JAK2基因V617F突變型，其檢測靈敏度達(dá)1%，而測序法靈敏度僅為20%。LNA PCR檢測JAK2基因V617F突變型的靈敏度與AS－PCR法和高分辨溶解曲線法一致［10，11］，而明顯高于限制性片段長度多態(tài)性分析法和常規(guī)測序法［9］，提示LNA PCR方法檢測JAK2基因V617F突變型具有良好的臨床應(yīng)用價值。

本研究采用LNA PCR方法在68例MDP患者中共檢測出JAK2基因V617F突變患者55例，在PV、ET和 MF患者中V617F突變率分別為91.89%、68.18%和66.67%，與相關(guān)研究［11，13］顯示的JAK2基因V617F突變的陽性率在PV為80%～90%、ET為40%～70%和MF為35%～57%相一致。提示LNA PCR檢測MPD患者JAK2基因V617F突變型方法可靠。

總之，本文建立的LNA PCR方法可有效檢測JAK2基因V617F突變，具有靈敏度高、應(yīng)用方便等特點。通過68例MPD臨床標(biāo)本的檢測結(jié)果表明，本方案能有效提高突變檢出率，有一定的臨床應(yīng)用價值。

1 Str obl B，Stoiber D，Sexl V，et al.Tyr osine kinase 2（TYK2）in cytokine signalling and host immunity［J］.Fr ontiers in bioscience：a journal and virt ual library，2011，16：3 214～3 232.

2 Staer k J，Kallin A，Royer Y，et al.JAK2，the JAK2 V617F mutant and cytokine receptors［J］.Pat hologie－biologie，2007，55（2）：88～91.

3 Pesum，Laurence A，Kishore N，et al.Therapeutic tar geting of Janus kinases［J］.Immunological reviews，2008，223：132～142.

4 Vardi man J，Hyjek E.World healt h organization classification，evaluation，and genetics of themyeloproliferative neoplas m variants［J］.Hematology Am Soc Hematol Educ Progra m，2011，2011：250～256.

5 Passamonti F.How I treat polycythemia vera［J］.Blood，2012，120（2）：275～284.

6 Kauppinen S，Vester B，Wengel J.Locked nucleic acid：high－affinity tar geting of complementar y RNA for RNo mics［J］.Handbook of experi mental phar macology，2006，173：405～422.

7 Veedu RN，Wengel J.Locked nucleic acids：pro mising nucleic acid analogs for therapeutic applications［J］.Chemistr y ＆ biodiversity，2010，7（3）：536～542.

8 Doessing H，Vester B.Locked and unlocked nucleosides in f unc－tional nucleic acids［J］.Molecules，2011，16（6）：4 511～4 526.

9 Sha mmaa D，Bazar bachi A，Halas H，et al.JAK2 V617F mutation detection：laboratory comparison of two kits using RFLP and qPCR［J］.Genetic testing and molecular bio mar kers，2010，14（1）：13～15.

10 Ho CL，Wu YY，Hung H M，et al.Rapid identification of heter ozygous or ho mozygous JAK2（V617F）mutations in myeloproliferative neoplas ms using melting curve analysis［J］.Journal of the For mosan Medical Association，2012，111（1）：34～40.

11 Frantz C，Sekora DM，Henley DC，et al.comparative eval uation of three JAK2 V617F mutation detection met hods［J］.A－merican journal of clinical pat hology，2007，128（5）：865～874.

12 Chae H，Lee JH，Li m J，et al.Usef ulness of real－ti me semiquantitative PCR，JAK2 MutaScreen kit for JAK2 V617F screening［J］.The Korean journal of laboratory medicine，2009，29（3）：243～248.

13 Kar kucak M，Yakut T，Ozkocaman V，et al.Evaluation of the JAK2－V617F gene mutation in Tur kish patients with essential thr ombocythemia and polycythemia vera［J］.Molecular biology reports，2012，39（9）：8 663～8 667.