肖永光 王賢燦

肖永光，王賢燦

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢，430060

冠心病的外科治療策略是利用血管橋重建心肌血供，靜脈是目前較為常用的血管橋。但移植后靜脈橋常因管壁增厚和管腔狹窄使臨床遠(yuǎn)期療效不佳［1］。造成這種結(jié)果的主要原因是血管壁中膜平滑肌細(xì)胞增生及其大量細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，因而如何抑制血管平滑肌細(xì)胞增生和減少細(xì)胞外基質(zhì)生成成為緩解靜脈橋狹窄的關(guān)鍵［2］。

吲哚胺2，3－過氧化酶（Indoleamine 2，3－dioxygenase，IDO）是肝外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的限速酶，其活性表達(dá)可引起細(xì)胞微環(huán)境中色氨酸分解代謝增強(qiáng)，從而抑制T細(xì)胞增殖。因此，它是一種潛在的免疫抑制酶，可以引起腫瘤的逃避和自體免疫耐受［3，4］。還有研究［5］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮源性IDO可以在調(diào)節(jié)血流穩(wěn)定方面起到一定作用。但I(xiàn)DO對移植靜脈橋發(fā)生狹窄有無影響，目前尚無報道。本文探討內(nèi)皮源性IDO對移植靜脈橋狹窄的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

成年長耳大白兔32只（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供），體重2.0～2.5 Kg，雌雄不限。隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組16只。實驗組為內(nèi)皮高表達(dá)IDO靜脈橋組，對照組僅注射質(zhì)粒載體，其余條件相同。

1.2 頸靜脈橋的制備

先將含有人IDO 基因（human IDO，hIDO）的質(zhì)粒（哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院劉漢忠教授惠贈）導(dǎo)入大腸桿菌，然后將大腸桿菌置入500 ml含氯霉素的Terrific肉湯培養(yǎng)基（預(yù)加溫至37℃），于37℃振搖培養(yǎng)（搖床轉(zhuǎn)速300r／min）16h，最后收集并裂解細(xì)菌，分離和純化質(zhì)粒。在靜脈橋移植前24h從實驗組大白兔耳緣靜脈注入質(zhì)粒，即可獲取血管內(nèi)皮高表達(dá)IDO的頸靜脈橋［6］。對照組質(zhì)粒載體內(nèi)不含IDO基因，其它培養(yǎng)條件同實驗組靜脈橋制備。

1.3 自體靜脈橋移植

各組實驗動物均用4%戊巴比妥鈉（30 mg／Kg）耳緣靜脈注射麻醉，并按1 mg／Kg劑量注入肝素抗凝。左頸部備皮，活力碘消毒。鋪無菌單，以胸鎖乳突肌中點為中心，作一2cm縱行皮膚切口。鈍性分離皮下組織，顯露左頸總動脈和頸外靜脈。阻斷頸外靜脈近、遠(yuǎn)兩端，剪取長約2cm血管橋，置于含肝素和罌粟堿的冰生理鹽水中待用。頸外靜脈兩斷端分別予以結(jié)扎。于頸總動脈近、遠(yuǎn)兩端分別阻斷，中間橫斷，在10倍手術(shù)顯微鏡下，用9－0醫(yī)用無損傷線將動脈兩端分別與靜脈橋行端端吻合。吻合完畢，松開近端血管夾，排氣，結(jié)扎縫線，最后松開遠(yuǎn)端血管夾。若吻合口滲血，用棉簽壓迫止血。吻合完畢見靜脈橋明顯擴(kuò)張、觸之可及震顫，表示靜脈橋通暢。術(shù)畢依層縫合，關(guān)閉切口。置動物于室溫，麻醉自然清醒。術(shù)畢每日觸摸頸部，靜脈橋處可及震顫。兩組動物均成功制備和移植自體靜脈橋。

1.4 標(biāo)本采集和處理

術(shù)后兩組動物常規(guī)飼養(yǎng)，手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后第7、14及21天隨機(jī)抽取兩組動物各4只，用上述相同方法麻醉后沿原切口切開，游離靜脈橋，清除靜脈壁外附著組織，阻斷兩端吻合處，向腔內(nèi)注入適量10%甲醛液，10 min后切取移植靜脈橋進(jìn)行常規(guī)病理切片，HE染色及PCNA免疫組化染色。實驗動物均放血處死。

1.5 觀察指標(biāo)

（1）HE染色后，以內(nèi)彈力膜為界，用IPP計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量移植靜脈橋中膜平均厚度。（2）計算靜脈橋中膜平滑肌細(xì)胞核PCNA染色陽性指數(shù)（PCNA指數(shù)為鏡下100個細(xì)胞中PCNA陽性細(xì)胞所占的百分率）。PCNA陽性細(xì)胞胞核呈棕色或深棕色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 兩組中膜厚度比較（n均＝4）

2 結(jié) 果

兩組移植靜脈橋均有不同程度增厚，且有隨移植時間延長而增加的趨勢。移植后第21天，實驗組靜脈橋中膜厚度測值（62.50±3.40μm）明顯低于對照組（112.30±7.80μm）（P＜0.05，圖1）。

但在術(shù)后靜脈橋持續(xù)增厚時，兩組中膜平滑肌細(xì)胞PCNA陽性指數(shù)由上升（術(shù)后第14天）轉(zhuǎn)為下降趨勢，術(shù)后第21天，實驗組PCNA陽性指數(shù)（14.00%±3.40%）明顯低于對照組（22.30%±5.40%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 兩組PCNA陽性指數(shù)比較（n均＝4）

3 討 論

研究［7］表明，靜脈橋發(fā)生狹窄的主要原因是血管壁中膜平滑肌樣細(xì)胞增生并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)在血管壁內(nèi)堆積，從而形成移植橋血管管腔狹窄，導(dǎo)致閉塞。內(nèi)皮源性IDO通過消耗血管壁中膜平滑肌細(xì)胞內(nèi)的三磷酸腺苷（ATP），造成這些細(xì)胞內(nèi)能源耗竭，使高爾基復(fù)合體內(nèi)的能量利用減少，從而減少蛋白合成，抑制細(xì)胞增殖的發(fā)生［8］。

本文結(jié)果顯示，在靜脈橋移植后兩組靜脈橋均有不同程度地增厚，移植后第21天實驗組靜脈橋中膜厚度明顯低于對照組，PCNA陽性指數(shù)明顯下降，表明內(nèi)皮源性IDO能夠有效緩解靜脈橋狹窄的發(fā)生。

本實驗結(jié)果還顯示靜脈橋在術(shù)后呈持續(xù)增厚時，平滑肌細(xì)胞的PCNA陽性指數(shù)從術(shù)后第14天開始呈下降趨勢，且在實驗組和對照組均出現(xiàn)上述現(xiàn)象，提示此時導(dǎo)致內(nèi)膜增厚的主要原因并非血管平滑肌細(xì)胞的增殖，而可能是由細(xì)胞外基質(zhì)堆積所致。另外觀察到，兩組靜脈橋內(nèi)膜和外膜PCNA陽性細(xì)胞較少，其厚度變化不明顯，可見橋靜脈管腔狹窄的主要原因是血管中膜增厚［9］。

綜上所述，內(nèi)皮源性IDO能夠有效緩解靜脈橋狹窄的發(fā)生，其對較晚期靜脈橋的狹窄除抑制平滑肌細(xì)胞增殖外，還可抑制蛋白質(zhì)合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，從而起到緩解靜脈狹窄的作用。

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5 Liu H，Visner GA.Applications of sleeping beauty transposons for nonviral gene therapy［J］.IUBMB Life，2007，59（6）：374～379.

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