曹 丹 李曉紅 任 艷，＊

曹 丹1，2，李曉紅1，任 艷1

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽110001； 2沈陽市第四人民醫(yī)院，沈陽110031

帕金森?。≒ar kinson Disease，PD）是以黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性壞死為病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)，免疫異?？赡芘cPD的發(fā)病機制有關(guān)，特別是細(xì)胞因子作為免疫炎性反應(yīng)產(chǎn)物參與該疾病的發(fā)生和發(fā)展日益受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［1］。干擾素－γ（IFN－γ）和白介素－10（IL－10）分別是具有代表性的 Th1型和 Th2型細(xì)胞因子，近年來研究發(fā)現(xiàn)兩者的比例失調(diào)對自身免疫性疾病和慢性炎癥性疾病有著重要作用［2，3］。刀豆蛋白 A （Con A）是一種植物血凝素，能在體外激活非特異性T細(xì)胞絲裂原，對調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)具有重要作用。已有作者使用Con A來活化PD患者外周血單個核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），在一定程度上調(diào)節(jié)了機體的免疫反應(yīng)［4］，進一步證實免疫機制參與了PD的發(fā)病。目前國內(nèi)外對PD患者外周血中細(xì)胞因子作用的研究報道不一致。因此，本文收集PD患者PBMC進行體外Con A刺激培養(yǎng)，分析其上清液中IL－10和IFN－γ的濃度變化，借以探討 Th1／Th2細(xì)胞因子在PD發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 對象與分組

23例PD患者均為本院神經(jīng)內(nèi)科門診和住院患者，并符合文獻診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。采用改良Hoenh and Yahr Scale分級量表（HYS）將患者病情分為I～Ⅴ期，并據(jù)此分為兩組，即早中期組（I～Ⅲ期）和晚期組（Ⅳ～Ⅴ期）。早中期組患者12例（男6例，女6例），病程4個月～5年；晚期組患者11例（男6例，女5例），病程5年～10年。健康對照組20例（男10例，女10例），年齡55～75歲，均來自本院健康體檢中心。三組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 主要試劑和儀器

Con A購自美國Sig ma公司。精確稱取Con A粉劑 用 RPMI－1640 液 配 制 成 10μg／ml溶 液，0.22μM濾膜過濾滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。人IFN－γ和IL－10檢測試劑盒購自武漢博士德公司；酶標(biāo)儀為瑞士SUNRISE RC。

1.3 外周血PBMC提取

參照有關(guān)文獻［6］，于清晨6∶00～8∶00空腹?fàn)顟B(tài)下采取各組受試者肘靜脈血5 ml，以密度梯度離心法提取PBMC。即在所取靜脈血中加入Hank’s緩沖液和淋巴細(xì)胞分離液（比重1.077），收集血漿與淋巴細(xì)胞分離液交界處PBMC，將其懸浮于含0.05%（g／ml）小牛血清的RPMI－1640中，用臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù)＞95%，用含小牛血清的RPMI－1640溶液均勻稀釋至2.5×106／ml后，加入24孔板中。以普通培養(yǎng)基（RPMI－1640）和Con A（終濃度10μg／ml［7］）培養(yǎng)基（RPMI－1640＋ Con A）分別對各組PBMC進行培養(yǎng)，即置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育48h。離心取上清液，于－80℃冰箱內(nèi)凍存。

1.4 IL－10和IFN－γ檢測

于37℃水浴箱內(nèi)解凍各組上清液，采用ELISA分別測定各組兩種培養(yǎng)上清液中IL－10及IFN－γ水平。檢測過程嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進行操作。酶標(biāo)儀檢測吸光度（OD）后，計算IFN－γ或IL－10濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。同組樣本的不同培養(yǎng)方法之間作配對t檢驗，分組樣本同一培養(yǎng)方法之間行組間t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)PBMC分泌IL－10濃度檢測結(jié)果

對照組和早中期組PD 患者PBMC在Con A培養(yǎng)條件下分泌IL－10水平高于普通培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；晚期組普通培養(yǎng)的PBMC分泌IL－10水平最低，受Con A刺激培養(yǎng)亦無顯著增加（P＞0.05）。與對照組相比，早中期組PBMC在兩種培養(yǎng)條件下分泌IL－10水平均有升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。而晚期組與早中期組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1和圖1。

表1 各組PBMC普通培養(yǎng)和Con A培養(yǎng)條件下分泌IL－10和IFN－γ水平比較（±s，pg／ml）

表1 各組PBMC普通培養(yǎng)和Con A培養(yǎng)條件下分泌IL－10和IFN－γ水平比較（±s，pg／ml）

注：與組內(nèi)普通培養(yǎng)比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與對照組同種培養(yǎng)比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；與早中期組同種培養(yǎng)比較，5）P＜0.05，6）P＜0.01

細(xì)胞因子 對照組（n＝20）普通培養(yǎng) Con A培養(yǎng)早中期組（n＝12）普通培養(yǎng) Con A培養(yǎng)晚期組（n＝11）普通培養(yǎng) Con A培養(yǎng)IL－10 5.82±3.74 7.87±3.211） 7.14±2.63 10.02±4.071） 3.81±1.046） 5.25±2.596）IFN－γ 202.32±30.68 323.63±37.77 1） 282.32±41.86 3） 721.43±65.73 2）4） 221.72±36.24 5） 414.63±40.69 1）6）

圖1 各組培養(yǎng)PBMC分泌IL－10水平比較

圖2 各組培養(yǎng)PBMC分泌IFN－γ水平比較

2.2 體外培養(yǎng)PBMC分泌IFN－γ濃度檢測結(jié)果

各組PD患者PBMC分泌IFN－γ水平Con A培養(yǎng)比普通培養(yǎng)升高（P＜0.05，P＜0.01）。早中期組Con A培養(yǎng)的IFN－γ濃度最高，顯著高于晚期組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），晚期組與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。見表1和圖2。

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明，PD發(fā)病與細(xì)胞免疫異常有關(guān)。Bogdan等［8］對PD患者外周血淋巴細(xì)胞進行了研究，發(fā)現(xiàn)其IL、TNF－α和INF－γ分泌比正常健康人顯著提高，Bongioanni等［9］研究證實PD患者外周血淋巴細(xì)胞上細(xì)胞因子的受體表達異常，還有一些關(guān)于外周血淋巴細(xì)胞亞群的研究也提示PD患者外周血中存在T細(xì)胞異常激活［10］以及淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)的現(xiàn)象［3，11］?；罨疶細(xì)胞分泌的Th1／Th2兩種類型的細(xì)胞因子中，Th1主要包括IL－2、IFN－γ、IL－12等，而 Th2包括IL－4、IL－10等。Con A是一種植物凝集素，可直接誘導(dǎo)靜息T細(xì)胞活化、增生、分化，繼而激活細(xì)胞因子引發(fā)炎癥反應(yīng)，調(diào)控機體免疫反應(yīng)。

本研究選取23例PD患者，根據(jù)其病情進行分期，檢測其PBMC在Con A誘導(dǎo)培養(yǎng)時的IL－10和IFN－γ分泌水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，早中期患者普通培養(yǎng)PBMC分泌IL－10有所增加，IFN－γ增加較多（P＜0.05），Con A刺激培養(yǎng)后的IFN－γ增加最明顯（P＜0.01）。提示早期PD患者外周免疫系統(tǒng)已存在異?，F(xiàn)象，表現(xiàn)為外周免疫細(xì)胞分泌抗炎因子基礎(chǔ)水平上升，受Con A刺激后進一步升高，而抑炎因子基礎(chǔ)水平也有所升高，刺激后升高明顯，從而發(fā)揮一定的炎癥調(diào)控作用，表明早期PD外周免疫系統(tǒng)存在異常激活和炎癥，此時免疫細(xì)胞具備一定調(diào)節(jié)能力。因此推測外周免疫系統(tǒng)的過度激活參與了PD的早期發(fā)病過程，如果能在此時加強免疫調(diào)控，有可能對PD病情進展實現(xiàn)有效干預(yù)。而PD晚期免疫系統(tǒng)功能進一步紊亂，體外培養(yǎng)PBMC分泌IL－10水平低于健康對照組（P＜0.05），Con A刺激后亦無顯著變化，表現(xiàn)為抑炎因子下降，并對刺激反應(yīng)不靈敏，提示免疫系統(tǒng)調(diào)控能力進一步下降，抑炎系統(tǒng)分泌抑炎因子拮抗炎癥的能力喪失殆盡。而IFN－γ在PD晚期基礎(chǔ)水平表達與對照組相近，當(dāng)PBMC受到Con A刺激后，分泌IFN－γ顯著增加。提示PDⅣ～Ⅴ期患者的PBMC激活進入衰退期，對有絲分裂原的刺激只存在有限的反應(yīng)能力。但由于基礎(chǔ)水平下降，外周免疫細(xì)胞參與、啟動免疫反應(yīng)的能力與早期相比明顯下降。PD晚期外周免疫功能全面下降和失衡，對腦內(nèi)神經(jīng)變性進展的參與能力也同樣下降，腦內(nèi)神經(jīng)變性繼續(xù)加重。

總之，PD的發(fā)病機制復(fù)雜，T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫系統(tǒng)的紊亂在PD發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。以往研究證實，多種細(xì)胞因子參與PD的進程，Mizuta等［12］研究發(fā)現(xiàn)早期IFN－γ濃度增加可能有助于延緩疾病的進程。因此，對PD進行早期免疫反應(yīng)干預(yù)可能對病程進展起延緩作用。

1 Kummer A，Teixeira AL.Depressive disorders in Par kinson’s disease may be due to a shared immune－mediated neurodegenerative process［J］.Med Hypotheses，2008，70（1）：201～202.

2 楊克平，張玉峰，李 欣.擴張型心肌病患者Th17／Treg的變化及意義［J］.微循環(huán)學(xué)雜志，2011，21（1）：32～34.

3 Ni wa F，Kuriyama N，Nakagawa M，et al.Effects of peripheral lymphocyte subpopulations and the clinical correlation with Parkinson’s disease［J］.Geriatr Gerontol Int，2012，12（1）：102～107.

4 Bessler H，Djaldetti R，Sal man H，et al.IL－1 beta，IL－2，IL－6 and TNF－alpha production by peripheral blood mononuclear cells from patients with Parkinson's disease［J］.Biomed Phar macother，1999，53（3）：141～145.

5 中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會運動障礙及帕金森病學(xué)組.帕金森病的診斷［J］.中華神經(jīng)科雜志，2006，39（6）：408～409.

6 蘇定雷，李元媛，王慧娟，等.霉酚酸對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細(xì)胞細(xì)胞因子分泌Th亞群的影響［J］.免疫學(xué)雜志，2006，22（5）：555～558.

7 蘇 聞，陳海波，王新德.帕金森病治療藥物對患者外周血單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2004，23（7）：454～456.

8 Brodacki B，Staszewski J，Toczylowska B，et al.serum interleukin （IL－2，IL－10，IL－6，IL－4），TNF－alpha，and INF－gamma concentrations are elevated in patients with atypical and idiopathic parkinsonism［J］.Neurosci Lett，2008，441（2）：158～162.

9 Bongioanni P，Mondino C，Borgna M，et al.T－lymphocyte immunointerferon binding in the parkinsonian patients［J］.J Neural Transm，1997，104（2～3）：199～207.

10 Stypula G，Kunert－Radek J，Stepien H，et al.Evaluation of interleukins，ACTH，cortisol and prolactin concentrations in the blood of patients with Parkinson's disease［J］.Neuroimmunomodulation，1996，3（2～3）：131～134.

11 Baba Y，Kuroi wa A，Uitti RJ，et al.Alterations of T－lymphocyte populations in Parkinson disease［J］.Par kinsonism Relat Disord，2005，11（8）：493～498.

12 Mizuta I，Nishi mura M，Mizuta E，et al.Relation between the high production related allele of the interferorr gamma（IFN－gamma）gene and age atonsetof idiopathic Parkinson’s disease in Japan［J］.J Neur ol Neurosur g Psychiatry，2001，71（6）：818～819.