張東浩 李 影

（吉林省結核病醫(yī)院檢驗科，吉林 九臺 130500）

結核病是目前嚴重威脅人類健康的重大傳染性疾病之一[1]，但只要早期診斷和合理用藥，絕大多數(shù)的結核病患者是可以治愈的。結核病是由結核分枝桿菌引起的一種以呼吸系統(tǒng)為主的傳染病，主要由含菌的飛沫通過呼吸道傳播。因此，結核病患者痰液中常含有一定量的結核分枝桿菌，通過查痰可及時發(fā)現(xiàn)，對結核病的診斷、治療及預后均有重要意義。而細菌學檢查是發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌的主要途徑，主要有抗酸菌涂片染色、培養(yǎng)分離、熒光定量PCR等方法。現(xiàn)就熒光定量PCR法進與另外兩種常規(guī)方法對結核病患者痰標本進行比較，評價其在結核分枝桿菌檢測中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2011年1月1日至2011年9月30日我院住院的肺結核患者，均為根據(jù)患者臨床癥狀、胸部影像學檢查、痰抗酸菌涂片染色、痰改良羅氏培養(yǎng)等確診的病例[2]，共計289例。其中男性153例，女性136例，年齡在15～86歲。

1.2 痰標本收集

囑患者留取清晨第一口痰。在留痰之前先用清水漱口數(shù)次，以清除口腔內(nèi)的食物殘渣及部分雜菌。留取的痰液應是用力咳嗽后自氣管內(nèi)咳出的痰，約2～3mL，然后乘于一次性無菌塑料標本盒中。不要將唾液或鼻涕吐入標本盒，以免影響檢驗結果。

1.3 試劑與儀器

抗酸菌涂片染色：試劑 按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第三版）（796）標準自行配置。無需特殊儀器。改良羅氏培養(yǎng)：試劑 羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術有限公司提供。4%NaOH由實驗室自行配置。儀器 隔水式培養(yǎng)箱由天津市泰斯特儀器有限公司提供。熒光定量PCR：試劑 熒光定量PCR檢測試劑由中山大學達安基因股份有限公司提供。4%NaOH由實驗室自行配置。儀器 LightCycler3.5全自動熒光定量基因擴增儀由羅氏公司提供。

1.4 方法

抗酸菌涂片染色：按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第三版）（795-796）標準執(zhí)行操作。改良羅氏培養(yǎng)：按照試劑配套說明書進行操作。熒光定量PCR：按照試劑配套說明書進行操作。

2 結 果

3種方法檢測痰中結核分枝桿菌的陽性檢出率分別為抗酸菌涂片染色法28.37%（82/289），改良羅氏培養(yǎng)法48.10%（139/289），熒光定量PCR法72.66%（210/289）。見表1。

表13 種檢測結核分枝桿菌方法的陽性率 （%）

3 討 論

我國是全球22個結核病高負擔國家之一，結核病的患患者數(shù)在世界居第2位?，F(xiàn)有肺結核患者約451萬，其中痰涂片陽性肺結核約150萬人（結核病傳染源），全國每年新發(fā)肺結核患者約145萬人，全年死于結核病者達12萬余人，相當于各種其他傳染病死亡人數(shù)總和的2倍[3]。因此，結核病的快速診斷依然是亟待解決的問題。

在眾多的輔助檢查中，細菌學檢查是結核病確診及發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，因此結核病患者的痰液檢查，具有重要的意義。

首先，具有診斷和鑒別診斷的價值：結核病的診斷依據(jù)是綜合性的，單靠臨床表現(xiàn)和影像學特征而缺乏病原學的檢查易出現(xiàn)漏診和誤診，以致延誤病情。而所有診斷依據(jù)中，病原學的檢查是核心，是確立診斷最肯定的檢查項目。一旦痰液中找到結核桿菌，結核病的診斷即可成立。因此，這是肺結核與肺癌及其他肺部疾病鑒別的最有利的檢查手段。

其次，幫助選擇合理的化療藥物：特別對初治原發(fā)耐藥和復治繼發(fā)耐藥患者意義重大。根據(jù)查痰后的藥敏結果，可以針對性選擇有效的全身化療藥物，比盲目的經(jīng)驗型選擇抗癆方案更科學、更合理，所取得的療效當然更好。

最后，判斷療效的最重要指標：結核病的療效判定亦是綜合性的，癥狀、體征、影像學檢查、實驗室檢查及其他輔助依據(jù)均為療效判斷指標之一，而細菌學的檢查最重要，特別是對菌陽患者，若菌陽患者痰菌逐漸減少以至轉陰，提示病情好轉，治療有效，結核菌絕大部分已被殺滅。若痰菌持續(xù)陽性，或菌陰患者一段時間后出現(xiàn)菌陽，考慮病情進展、惡化、治療無效，必要時需要更改方案。因此痰菌檢查可直觀地判斷療效，及時地明確目前病情。

痰涂片抗酸染色檢查是全世界結核病實驗室都在使用的最基本的細菌學檢查方法。其優(yōu)點是簡便、快速和廉價，1～2小時即可回報結果，對結核病早期診斷起著重要作用；缺點是無法辨別死菌與活菌。該法受實驗室條件、檢驗人員的涂片、染色、鏡檢技術水平的影響較大，且靈敏度低，通常需5000～10000條菌/毫升才能得到陽性結果，且結核病患者常為間歇性排菌，可能造成假陰性結果。特意相差，而且各種抗酸桿菌均可找色，需進一步試驗才能確定是否為結核分枝桿菌。有些耐藥菌或經(jīng)化療后的結核病患者的痰排菌轉為L型，對抗酸染色不敏感，難以查到，而出現(xiàn)假陰性結果。

改良羅氏培養(yǎng)法的優(yōu)點是靈敏度略高于涂片法，特異性好，并可鑒定死菌與活菌，還可以進一步藥物敏感性的鑒定，被譽為結核病診斷的“黃金標準”；缺點是用時太長，通常需6～8周才能獲得結果，而且非結核分枝桿菌也可生長，需進行菌種鑒定方可確定是否為結核分枝桿菌。由于上述原因，致使結核病細菌學檢查一直不能滿足臨床診斷的需求[4]。

熒光定量PCR是一種密閉的擴增檢測系統(tǒng)，所檢測的是結核分枝桿菌的特異DNA片段，具有敏感度、特異度高及方便快速、自動化程度高等優(yōu)點，結果分析由計算機自動完成，特別是對難以培養(yǎng)與生長緩慢的結核桿菌的檢測更有優(yōu)勢[5]。陽性下限僅為10個拷貝/毫升，操作簡單，只需2～3h即可完成。實際操作中熒光定量PCR的定量結果，可以指導臨床用藥和療效評估。

綜上所述，熒光定量PCR方法檢測痰中結核分枝桿菌具有靈敏度高、操作簡便、快速的特點，結果真實可靠，可作為結核病的常規(guī)診斷方法，在臨床上有重要的應用價值。

在實際應用中，抗酸菌涂片法和熒光定量PCR法可為臨床及時提供診斷依據(jù)，培養(yǎng)及藥敏失言可指導臨床用藥，熒光定量PCR檢測結核分枝桿菌DNA濃度可用于判斷療效。因此，應根據(jù)需要，合理選擇和組合檢測方法，方能更好的為臨床提供科學證據(jù)。

[1]衛(wèi)生部殷大奎副部長在2001年“3.24”世杰防治結核病日專家座談會上的講話[J].中國防癆雜志,2001,23(4):207.

[2]肖東樓,趙明.中國結核病防治規(guī)劃實施工作指南[S].2008:25-26.

[3]樊學軍,孫敏.結核病實驗室診斷技術的比較研究[J].中國國境衛(wèi)生檢驗雜志,2005,28(1):160-162.

[4]張翊,盧建平,葉淼.四種結核分枝桿菌檢測方法的臨床應用評價[J].中國防癆雜志,2006,28(1):14-17.

[5]彭麗,羅永艾.結核病的實驗室快速診斷[J].新醫(yī)學,2005,36(1):359-361.