段利平，劉記言，劉學(xué)娟，楊德娥，朱云勇，白紅麗

（云南民族大學(xué) 國家民委－教育部民族藥資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650031）

彝藥滇藁本為傘形科滇芹屬（Sinodielsiayunnanensis Wolff），別名巖林、巖前胡，產(chǎn)自云南中部和西部，始載于《滇南本草》，治頭風(fēng)疼痛，止諸頭疼，明目［1］。彝族主要用于偏頭痛，腎盂腎炎，呼吸道感染等癥［2］。初步研究表明，滇藁本能減緩血細(xì)胞凝聚。為了更好的挖掘利用民族藥資源，最大限度的提取其中的有效成分，筆者對(duì)滇藁本進(jìn)行了醇提工藝的研究，建立了滇藁本中總黃酮類化合物的高效液相色譜測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 藥 材、儀器及試劑 藥材：滇藁本采自紅河哈尼族彝族自治州瀘西縣，經(jīng)鑒定為傘形科滇芹屬（Sinodielsiayunnanensis Wolff）的根部，粉碎過40目篩，干燥保存。試劑：鹽甲醇（色譜純）；槲皮素（對(duì)照品，中國藥品生物制品檢定所）；去離子水。儀器：Agilent1100型高效液相色譜儀、Zorba／sb－C18色譜柱（150.0mm ×4.6mm，5μm）、紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)、智能化柱溫箱及Agilent化學(xué)工作站、R－114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BüchI）、電熱恒溫水浴鍋、CQX25－06超聲波清洗器、AE100型電子天平。

1.2 方法和結(jié)果

1.2.1 黃酮類檢測(cè) 取滇藁本藥材粗粉10g，加甲醇70mL，置水浴中回流10min，趁熱過濾。取濾液2滴于濾紙上，加10%三氯化鋁乙醇溶液2滴，揮干，置熒光燈下觀察，有熒光產(chǎn)生。

1.2.2 提取工藝條件的確定 采用正交試驗(yàn)來確定滇藁本中黃酮類化合物最佳提取工藝條件。以總黃酮的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取方法（C）、提取時(shí)間（D）為考察的4個(gè)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平（表1），選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)（表2）。取藥材每份50g，提取液過濾、減壓蒸餾濃縮浸膏，再定容至50mL容量瓶中，作為供試液備用。測(cè)定前充分搖勻。按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求試驗(yàn)。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

1.2.3 結(jié)果方差分析 對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由滇藁本藥材粗粉中槲皮素含量的直觀分析結(jié)果可知，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度為A＞D＞B＞C，所得最佳提取工藝為A3B1C1D3。由方差分析可知，提取方法、加醇量、提取時(shí)間、乙醇濃度對(duì)滇藁本藥材粗粉的槲皮素含量和總固體物收率都有顯著的影響，但提取時(shí)間影響最顯著，確定最佳提取工藝為A3B1C1D3。即加8倍量的70%乙醇，熱回流提取3h。F1－0.05（2，2）＝19.0，F(xiàn)1－0.01（2，2）＝99.0，F(xiàn)1－0.10（2，2）＝9.00。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 對(duì)照品貯備液的制備 取干燥至恒重的對(duì)照品，精密稱定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 供試品溶液的制備 取樣品約5mL，用20mL甲醇于超聲波浴中提取30min，過濾后濾液加入20mL 1.5mol／L鹽酸于水浴上回流水解3h，冷卻后用甲醇定容至50mL量瓶中，該樣液過0.5μm膜，濾液進(jìn)HPLC分析。

2.3 測(cè)定波長的選擇與色譜條件 色譜條件 固定相：Zorba／sb－C18色譜柱（150.0mm ×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸（50∶50）；流速：10μL／min；檢測(cè)波長：371nm；柱溫：20℃。分離度符合要求。測(cè)定波長的選擇 使用HPLC在線掃描槲皮素的對(duì)照品紫外光譜圖中（以流動(dòng)相為溶劑），最大吸收波長為371nm（見圖1）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為使成分的色譜峰相匹配，本實(shí)驗(yàn)中選擇371nm為測(cè)定波長。

圖1 HPLC在線掃描槲皮素對(duì)照品紫外光譜圖

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取供試品及對(duì)照品溶液，注入色譜儀，在上述色譜條件下進(jìn)樣，得HPLC圖譜（見圖2（A、B），分析得系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2（A） 槲皮素對(duì)照品的HPLC圖譜

圖2（B） 供試品的HPLC圖譜

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 線性關(guān)系考察 精密稱取槲皮素對(duì)照品2.9mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密吸取1.0mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即為槲皮素對(duì)照品貯備液；精密吸取以上貯備液，按表1設(shè)計(jì)進(jìn)樣量進(jìn)行HPLC，測(cè)定色譜峰面積，以峰面積（A）對(duì)對(duì)照品濃度（C）進(jìn)行回歸分析。測(cè)得槲皮素對(duì)照品的線性回歸方程為：y＝32.151x＋11.333，r＝0.9998。表明槲皮素在0.0464～0.1624μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在色譜條件下，取同一份滇藁本藥材粗粉的供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果槲皮素峰面積值RSD＝0.94%。表明在10h內(nèi)樣品溶液中的槲皮素穩(wěn)定。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值，計(jì)算RSD＝0.35%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批號(hào)樣品6份，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備并測(cè)定，結(jié)果槲皮素含量為的0.0132%。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取干燥至恒重的對(duì)照品適量，加入溶劑制成回收率試驗(yàn)用對(duì)照品儲(chǔ)備液。取已知槲皮素含量（0.01585mg／mL）的樣品6份，每份約0.65g，分別精密加入槲皮素對(duì)照品溶液（0.0116mg／mL）1mL，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備并測(cè)定，結(jié)果平均回收率為96.44%，RSD為1.51%。

2.10 樣品含量測(cè)定 取不同批號(hào)的樣品數(shù)批，依測(cè)定條件，制成供試品溶液，注入色譜儀，測(cè)定，記錄并計(jì)算指標(biāo)槲皮素的含量。見表3。

表3 槲皮素含量測(cè)定

3 討論

滇藁本藥材粗粉中含多種黃酮類化合物，根據(jù)黃酮類化合物在70%乙醇中具有良好溶解性的特點(diǎn)，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中選擇70%乙醇作提取溶劑。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分析滇藁本藥材粗粉中黃酮類化合物大多以糖苷的形式存在，主要為槲皮素及苷、山柰素及苷等，直接測(cè)定滇藁本藥材粗粉中槲皮素的含量，發(fā)現(xiàn)其含量很低，并且直接測(cè)定可能難以準(zhǔn)確反映其中總黃酮的實(shí)際含量，因此本試驗(yàn)采取酸水解后測(cè)定其槲皮素的含量，獲得滿意效果。對(duì)于水解條件的選擇，考察了不同鹽酸濃度和酸水解時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，用鹽酸（1.5mol／L）－甲醇（1∶1）回流3h，能使滇藁本藥材粗粉中以槲皮素為苷元的黃酮苷水解完全，鹽酸的濃度不宜再高，酸性太強(qiáng)對(duì)進(jìn)樣閥和色譜柱的腐蝕作用較大。色譜條件摸索時(shí)，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜峰的峰形及分離度影響很大，比較甲醇與不同濃度的磷酸溶液等多種溶劑系統(tǒng)，確定流動(dòng)相為甲醇－0.1%磷酸（50∶50），得到的色譜峰峰形尖銳，分離度高，且基線穩(wěn)定。

［1］《滇南本草》整理組 .滇南本草［M］.昆明：云南人民出版社，1978.

［2］江蘇植物所 .新華本草綱要［M］.上海：上?？萍汲霭嫔?，1988.

［3］HU Min，SKIBSTED L H.Antioxidative capacity of rhizome extract and rhizome knot extract of edible lotus（Nelumbo nuficera）［J］.Food Chem，2002，76：327～333.

［4］左愛華，韋群輝，曾元兒，等 .紫外可見分光光度法測(cè)定青刺尖總黃酮含量［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2008，（6）：43～44.