韓 曦 齊亞靈 田國(guó)忠 扈清云 魏 罡 王培軍 歐葉濤 張東東 陳乃峰 鐘堂武

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

慢性心力衰竭(CHF)是心血管疾病中一種常見(jiàn)的嚴(yán)重綜合征，死亡率高，預(yù)后差。研究表明細(xì)胞因子的激活，在CHF的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。內(nèi)皮素－1(ET－1)在正常人血漿中含量較低，但CHF患者血漿中含量顯著升高，是判斷CHF的重要指標(biāo)，對(duì)心衰的治療效果及預(yù)后判斷起到十分重要的作用。生長(zhǎng)激素釋放肽(GHRP)是一類人工合成的短肽，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。目前關(guān)于GHRP對(duì)細(xì)胞因子的影響報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)以ET－1作為研究對(duì)象，探討GHRP對(duì)心臟保護(hù)的分子生物學(xué)機(jī)制，以期為治療CHF提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 260～320 g健康Wistar大鼠(雄性)60只，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑 鹽酸阿霉素(ADR，浙江海正藥業(yè)股份有限公司);GHRP－2(上海超研生物科技有限公司);ET－1 ELISA試劑盒(上海超研生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組及造模 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和GHRP組，每組20只。對(duì)照組，腹腔注射(ip)與ADR等體積生理鹽水;模型組，第 2、4 天 ip ADR 1 mg/kg，第6、8 天 ip ADR 2 mg/kg，第10、12 天ip ADR 3 mg/kg，第14、16 天 ip ADR 4 mg/kg，去除死亡大鼠2只;GHRP組，ip ADR，方法同模型組，且第10～18天尾靜脈注射GHRP－2 25 g/kg，每天一次，第19天取材。

1.4 心功能測(cè)定 取材前描記肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖;接小動(dòng)物呼吸機(jī);頸外靜脈插管，并注入肝素;頸總動(dòng)脈插管，描記相關(guān)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。

1.5 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 心功能測(cè)定后，沿前室間溝按長(zhǎng)軸將心臟切成厚約4～5 mm的塊狀組織，固定，制成5 μm厚石蠟切片，在400倍鏡下觀察HE染色后心肌細(xì)胞形態(tài)變化。

1.6 ELISA法檢測(cè)心肌組織中ET－1含量 采用雙抗體夾心ABC－ELISA法，具體操作參照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度。建立回歸方程，計(jì)算出樣品實(shí)際濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果用±s表示;組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 心功能變化 對(duì)照組大鼠心電圖正常，以R波為主;模型組QRS波峰降低，心率加快;GHRP組心電圖較模型組有所改善，見(jiàn)圖 1。模型組舒張期左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)明顯低于對(duì)照組，且有明顯差異(P＜0.05)。GHRP組與對(duì)照組比較，±dp/dtmax無(wú)明顯差異(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心率、左室內(nèi)壓最大變化速率的比較(±s)

表1 各組大鼠心率、左室內(nèi)壓最大變化速率的比較(±s)

與模型組比較:1)P＜0.05

組別 n 心率(次/min)+dp/dtmax(mmHg/s)+dp/dtmax(mmHg/s)對(duì)照組 20 342.10±25.73 3 717.30±602.391)3 250.75±606.721)模型組 18 383.06±27.841) 2 321.44±311.57 1 776.28±374.35 GHRP組 20 364.20±24.42 3 381.25±459.511)2 880.95±558.231)

圖1 各組大鼠心電圖

2.2 各組心肌組織HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，橫紋明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，細(xì)胞間質(zhì)水腫，細(xì)胞變性、溶解，染色變深，有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);GHRP組與對(duì)照組比較，心肌細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖2。

2.3 各組心肌組織中ET－1含量 各組心肌組織中ET－1含量模型組(15.09±2.14)明顯高于對(duì)照組(3.84±0.47)和GHRP組(4.28±0.85)(P＜0.05);而 GHRP組與對(duì)照組比較，ET－1含量升高，但差異不顯著(P＞0.05)。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)結(jié)果(HE，×400)

3 討論

CHF是臨床上一種常見(jiàn)的危重病癥，死亡率較高。近年來(lái)對(duì)心衰的研究已成為我國(guó)乃至全球醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)。越來(lái)越多的研究表明:細(xì)胞因子的激活在CHF的病理生理和發(fā)病機(jī)制中起重要作用〔1，2〕。在細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中，ET－1在正常生理情況下，含量很少，而在病理情況下，含量顯著升高〔3〕，可達(dá)幾倍，甚至幾十倍，ET－1濃度升高與CHF嚴(yán)重程度密切相關(guān)〔4〕，是CHF患者獨(dú)立的預(yù)后因素，但目前關(guān)于CHF時(shí)心肌組織中ET－1的變化，文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心肌組織中的ET－1含量小于有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的血漿中的濃度，這是因?yàn)檠獫{中ET－1含量來(lái)源較復(fù)雜而廣泛，心肌組織中ET－1的產(chǎn)生參與了血漿ET－1含量的組成，并且模型組心肌組織中ET－1的含量高于對(duì)照組。CHF越嚴(yán)重，心功能越差，ET－1含量越高，CHF經(jīng)治療后心功能好轉(zhuǎn)，ET－1含量下降，提示ET－1水平反映了心功能損害的程度。推測(cè)發(fā)生CHF時(shí)，ET－1的表達(dá)增加，濃度升高〔5〕，心肌ETA 受體(ETAR)和ETB受體(ETBR)密度上調(diào)，處于衰竭中的心臟收縮功能進(jìn)一步減退，而肺部與ET－1清除有關(guān)的ETBR的減少將進(jìn)一步升高ET－1的水平。至于心肌組織中ET－1的變化在CHF發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

本文結(jié)果顯示，經(jīng)GHRP治療后，GHRP組與模型組比較，水腫的心肌細(xì)胞趨于正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)消失，心肌組織中ET－1的含量降低，推測(cè)GHRP可能通過(guò)腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，降低血管緊張素Ⅱ濃度，減少對(duì)心肌正常功能的損傷〔6〕;抑制交感神經(jīng)激活，防止CHF向不良方向發(fā)展，從而改善心肌重塑，對(duì)CHF大鼠的心功能起到保護(hù)和改善的作用。心電圖顯示GHRP組心電圖較模型組有所改善，并且心率明顯下降，左室內(nèi)壓最大上升和下降速率明顯增加，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致，表明GHRP能夠通過(guò)調(diào)節(jié)血流動(dòng)力學(xué)來(lái)改善心功能〔7〕。

另外，亦有研究顯示GHRP改善心功能是通過(guò)神經(jīng)體液因素的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的。De Gennaro Colonna等〔8〕實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):GH的減少抑制了離體大鼠心臟部分前列環(huán)素(PGI2)的形成，并且能增強(qiáng)動(dòng)脈平滑肌對(duì)血管緊張素Ⅱ的反應(yīng)性，增強(qiáng)血管對(duì)內(nèi)皮素－1 反應(yīng)性，明顯減弱血管平滑肌對(duì) NG－monomethyl－L－arginine(NO合成酶抑制劑)的反應(yīng)性。GHRP能增高心肌中膽堿能神經(jīng)纖維和腎上腺素能神經(jīng)纖維密度，延緩心衰后的去神經(jīng)支配，改善神經(jīng)重構(gòu)〔9〕。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)認(rèn)識(shí)到GHRP能夠降低心肌中ET－1的含量，說(shuō)明GHRP能通過(guò)細(xì)胞因子的調(diào)控改善心功能。21世紀(jì)隨著心衰生物學(xué)治療的開(kāi)展，GHRP可為有效改善CHF心臟生物學(xué)功能發(fā)揮更為積極作用。

1 Konig D，Neubauer O，Nics L.Biomarkers of exercise－induced myocardial stress in relation to inflammatory and oxidative stress〔J〕.Exerc Immunol Rev，2007;13(1):15－36.

2 Gheorghiade M，De Luca L，Bonow RO.Neurohormonal inhibition in heart failure:insights from recent clinical trials〔J〕.Am J Cardiol，2005;96(12):3－9.

3 李 香，金 哲，崔 瑛，等.慢性心力衰竭與血漿一氧化氮、內(nèi)皮素及前列環(huán)素動(dòng)態(tài)變化的關(guān)系〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008;28(14):1425－7.

4 Ohmae M.Endothelin－1 levels in chronic congestive heart failure〔J〕.Wiener Klinische Wochenschrift，2011;123(23－24):714－7.

5 Parker JD，Thiessen JJ.Increased endothelin－1 production in patients with chronic heart failure〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004;286(3):1141－5.

6 宋漢君，田國(guó)忠，韓 曦，等.GHRP對(duì)心衰大鼠心功能及細(xì)胞因子的影響〔J〕. 中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(14):2691－2.

7 Xu XB，Cao JM，Pang JJ，et al.The positive inotropic and calcium－mobilizing effects of growth hormone－releasing peptides on rat heart〔J〕.Endocrinology，2003;144(11):5050－7.

8 De Gennaro Colonna V，Rossoni G，Bernareggi M，et al.Cardiac ischemia and impairment of vascular endothelium function in hearts from growth hormone－deficient rats:protection by hexarelin〔J〕.Eur J Pharmacol，1997;334(2－3):201－7.

9 馮 佳，田國(guó)忠，趙 勇，等.生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)心衰大鼠植物神經(jīng)重構(gòu)的影響〔J〕. 神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2009;25(4):453－6.