龍吉美,黃德彬,李魁武,羅 瓊
(1湖北省建始縣人民醫(yī)院,湖北 建始 445300;2湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院,湖北 恩施 445000)
鉤藤堿(rhynchophylline,RHL)系茜草科植物鉤藤[Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jackson]的主要成分。鉤藤水提取物具有息風(fēng)定驚、清熱平肝等功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),RHL具有保護(hù)腦缺血再灌注所致的腦損傷作用,還具有顯著的鈣拮抗、抑制心肌重構(gòu)、降低血壓、抗心律失常等作用[2]。臨床用于治療高血壓、支氣管哮喘、癲癇等疾病[3]。有研究報(bào)道,鉤藤堿和異鉤藤堿能顯著抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)所導(dǎo)致的血管重塑[3],其機(jī)制與下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)及抑制c-myc、c-fos基因mRNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)[2]。我們研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿具有改善阿霉素腎病大鼠腎功能的作用,其機(jī)制與增強(qiáng)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,減少丙二醛(malondialdehyde,MDA)生成,調(diào)控腎組織血管緊張素受體1、2(angiotensin receptors 1,2,AT1,2- R)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin - converting enzyme,ACE)和 血管緊張素原(angiotensinogen,AGT)mRNA表達(dá)等相關(guān)。但RHL對(duì)阿霉素腎病大鼠腎損傷的作用尚不清楚,本研究觀察RHL對(duì)阿霉素致大鼠腎功能損傷的作用并探討其機(jī)制。
1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)成年雌性SD大鼠52只,體重 (180±20)g(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,4110817)。分籠飼養(yǎng)(每籠3~4只),溫度維持在(25±3)℃,相對(duì)濕度(55±15)%,按光照與黑暗每天12 h輪替。飼料與飲水均經(jīng)滅菌處理。
1.2 器材 大鼠代謝籠(M-5,1410 mm×400 mm×1550 mm,上海中勝科教設(shè)備有限公司);全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)思博名科學(xué)器材公司);石蠟包埋機(jī)(EG1150-H);切片機(jī)(RM2245);全自動(dòng)組織脫水機(jī)和顯微鏡(DM2000);全自動(dòng)顯微鏡數(shù)碼攝像系統(tǒng)(Olympus);電子分析天平(Sartorius);3K30型低溫高速離心機(jī)(Sigma);超純水裝置(Millipore);Du-7500紫外分光光度計(jì)(Beckman);TP600型PCR基因擴(kuò)增儀(TaKaRa);電泳儀及電泳槽(江蘇儀器廠);LG2020D型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司);F200酶標(biāo)儀(帝肯);微量加樣器(Gilson)。
1.3 主要試劑 水合氯醛(上海金貿(mào)泰化工有限公司);鉤藤堿(RHL,Sigma);阿霉素(adriamycin,ADR,Sigma);SOD 和MDA檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所,NBT法和TBA法);伊紅、蘇木素、多聚賴氨酸、S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司);PCR引物和DL2000 DNA marker(大連寶生物工程公司);PV6001二步法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋);Trizol Reagent和引物核苷酸片段(Invitrogen);M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega);瓊脂糖(Promega);PCR Mix試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。
2.1 動(dòng)物分組與處理 隨機(jī)將大鼠分成4組,即生理鹽水組(NSG,n=10)、模型組(MG,n=14)、鉤藤堿低劑量治療組(RHL-LG,n=14)和高劑量治療組(RHL-HG,n=14)。MG、RHL-LG和RHL-HG經(jīng)尾靜脈注射阿霉素(5 mg·kg-1)制造腎病模型,NSG注射等容量生理鹽水(NS)。2周后檢測(cè)尿蛋白含量為(+++)者納入腎病模型實(shí)驗(yàn)(比例為65%),MG、RHL-LG和 RHL-HG分別為8只、10只和9只。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,RHL-LG和RHL-HG分別給予腹腔注射 RHL 5mg·kg-1和 15 mg·kg-1[4],NSG、MG分別給予腹腔注射等容量NS,共治療8周。
2.2 標(biāo)本收集
2.2.1 血液標(biāo)本采集 自眼眶靜脈叢采血。先按壓大鼠頸部?jī)蓚?cè),讓眼眶靜脈叢充分充血,以毛細(xì)玻璃管自眼內(nèi)角呈45°角刺入,采集血液約 1~2 mL,室溫靜置 15 min,4 ℃、3000 r/min離心15 min,吸取血清,以生化指標(biāo)檢測(cè)備用。
2.2.2 尿液的收集 用代謝籠采集尿液標(biāo)本。分別于0周、2周、4周、6周、8周的最后1 d收集24 h尿液標(biāo)本,測(cè)量24 h尿量,吸取尿液,25℃、1000 r/min離心10 min后,取上清液放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.2.3 腎組織標(biāo)本采集 動(dòng)物處死前,以水合氯醛(10%,3mg/kg)腹腔麻醉,迅速摘下右腎置入液氮保存?zhèn)溆?。左腎以4%多聚甲醛固定,HE染色、免疫組化染色備用。
2.3 標(biāo)本檢測(cè)
2.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清和尿液中總蛋白、白蛋白、血清肌酐(serum creatinine,SCr)及血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)等指標(biāo)。24 h尿蛋白定量計(jì)算方法[5]:24 h尿蛋白定量(mg/d)=尿蛋白濃度(mg/L)×24 h尿量(L)。
2.3.2 MDA含量與SOD活性分析 嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書用試劑盒檢測(cè)MDA含量和SOD活性,簡(jiǎn)要地說(shuō),就是用勻漿機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝組織勻漿,取上清液樣品用于MDA含量和SOD活性分析,在586 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)MDA含量 和SOD活性。
2.3.3 病理學(xué)檢測(cè)(HE染色) 以10%甲醛固定24 h,經(jīng)梯度乙醇(70%、80%、95%、100%)脫水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明處理,常規(guī)浸蠟包埋,脫蠟,蘇木素染核,分化,反藍(lán),脫水,中性樹膠封固。
2.3.4 RT - PCR 檢測(cè) AT1,2- R、ACE 及 AGT mRNA 表達(dá)按文獻(xiàn)[6]用RT-PCR法半定量分析各自mRNA水平(用Trizol試劑提取腎組織總RNA)。取100 mg液氮凍存腎組織研磨,加入Trizol 1 mL,用勻漿器勻漿,25℃孵育10 min。4℃、12000×g離心5 min,棄沉淀。吸取上清液加入新離心管,加入氯仿200 μL,混勻,于 25℃靜置 5 min,再離心 15 min(12000×g、4℃)。吸取上清液,加入另一離心管,加入0.5 mL異丙醇,25℃靜置10 min。繼續(xù)離心10 min(4℃、12000×g),去除上清液,以乙醇洗滌RNA沉淀(75%,1 mL),混均勻。離心5 min(4℃、80000×g),棄上清。再漂洗沉淀,25℃晾干,沉淀 RNA 10 min。用 30~50 μL RNase-free ddH2O溶解沉淀,55℃水浴助溶10 min,漩渦混勻30 s,離心(4℃、120000×g),得到上清RNA樣品。
RT反應(yīng):取5 μL加入DEPC處理的45 μL無(wú)菌水,用紫外分光光度計(jì)測(cè)量A值檢測(cè)RNA(A260/A280在1.8~2.0為純度合格)。另取5 μL,以瓊脂糖甲醛變性膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行鑒定,余下部分于-85℃冰箱保存?zhèn)溆?。按AMV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書進(jìn)行第一鏈cDNA合成。取AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL,5×RT 反應(yīng)緩沖液4 μL,dNTP 混合物4 μL(每種2.5 mmol/L),Oligo dT15Primers 2 μL(50 μmol/L),總 RNA 2 μg,最后加入適量RNase-free ddH2O至總體積達(dá)20 μL。將混合物置10 min(25℃),置入水浴孵育1 h(42℃)得cDNA,吸取cDNA 2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR 反應(yīng):2 μL cDNA,12.5 μL 2 × Taq Master,10 pmol相應(yīng)引物,加入適量ddH2O至25 μL。吸取10 μL擴(kuò)增物,用瓊脂糖凝膠(2%)行DNA電泳,Tanon-1600 Figure Gel凝膠成像系統(tǒng)拍照,以軟件GIS1D Gel Image System分析條帶吸光度(A值),結(jié)果以目的基因和β-actin A值比值表示。其引物序列如下:AT1-R上游引物5'-GCACAATCGCCATAATTATCC -3',下游引物 5'- CACCTATGTAAGATCGCTTC -3',擴(kuò)增片段445 bp,退火溫度53℃;AT2-R上游引物5'-GTGTCCAGCATTTACATCTTCA -3',下游引物 5'-CACCAAACAAGGGGAACTAC-3',擴(kuò)增片段275 bp,退火溫度,55℃;ACE 上游引物5'-GCAGAACTTCACTGACCAAAAG -3',下游引物5'-TCAAAGGAGGGGGACTCATA-3',擴(kuò)增片段 383 bp,退火溫度55℃;AGT上游引物5'-TTGTTGAGAGCTTGGGTCCCTTCA-3',下游引物 5'-CAGACACTGAGGTGCTGTTGTCCA-3',擴(kuò)增片段265 bp,退火溫度60℃;β-actin上游引物5'-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3',下游引物5'-AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC -3',擴(kuò)增片段617 bp,退火溫度55℃。
MG、RHL-LG和RHL-HG經(jīng)尾靜脈注射阿霉素2周后出現(xiàn)蛋白尿,顯著高于NSG(P<0.05),表明急性腎功能衰竭模型制造成功。24 h尿蛋白含量從2~8周呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。RHL-LG顯著低于MG,而高于RHL-HG(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢(shì),見圖1。
Figure1.Effect of RHL on 24 h urine protein in rats.*P <0.05vs NSG;△P<0.05 vs MG;▲P<0.05 vs RHL-LG.圖1 RHL對(duì)大鼠24 h尿蛋白的影響
MG、RHL-LG和RHL-HG血清中BUN和SCr顯著高于NSG(P<0.05),表明急性腎功能衰竭模型制造成功。其中,RHL-LG血清中的BUN和SCr顯著低于MG,而高于RHL-HG(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢(shì),見表1。
表1 RHL對(duì)大鼠血清中BUN和SCr含量的影響Table1.Effects of RHL on BUN and SCr in rats()
表1 RHL對(duì)大鼠血清中BUN和SCr含量的影響Table1.Effects of RHL on BUN and SCr in rats()
*P<0.05 vs NSG;△P<0.05 vs MG;▲P<0.05 vs RHLLG.
Group n BUN(mmol/L) SCr(μmol/L)NSG 10 7.93 ±1.67 31.58 ±2.06 MG 8 23.43 ±2.54* 56.84 ±3.25*RHL - LG 10 16.95 ±1.83*△ 44.15 ±2.76*△RHL - HG 9 10.17 ±1.37*△▲ 37.92 ±3.71*△▲
與NSG相比,MG、RHL-LG和RHL-HG大鼠腎小球毛細(xì)血管顯著充血,系膜區(qū)明顯增厚,系膜基質(zhì)顯著增多,足突細(xì)胞明顯肥大。RHL-LG的炎癥、系膜區(qū)增厚和系膜基質(zhì)增多明顯輕于MG,腎小球充血及腎小球管型明顯少于MG。而RHL-HG的病理改變又顯著輕于RHL-LG,見圖2。
Figure2.Effects of RHL on the morphology of rat renal tissues(HE staining,×400).圖2 RHL對(duì)大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響
MG、RHL-LG和RHL-HG大鼠腎組織中SOD活性顯著低于NSG(P<0.05);MG顯著低于RHL-LG,而RHLLG又明顯低于 RHL-HG(P<0.05)。MG、RHL-LG和RHL-HG大鼠腎組織中 MDA含量顯著高于 NSG(P<0.05);MG顯著高于 RHL-LG,而RHL-LG又明顯高于RHL-HG(P<0.05),見表2。
表2 RHL對(duì)大鼠腎組織中SOD活性與MDA含量的影響Table2.Effects of RHL on SOD activity and MDA content in rat renal tissues()
表2 RHL對(duì)大鼠腎組織中SOD活性與MDA含量的影響Table2.Effects of RHL on SOD activity and MDA content in rat renal tissues()
*P<0.05 vs NSG;△P<0.05 vs MG;▲P <0.05 vs RHL-LG.
Group n SOD[μmol/(g protein)]MDA[μmol/(g protein )]NSG 10 533.62±27.71 1.37±0.25 MG 8 297.54±21.57* 4.08±0.41*RHL-LG 10 379.46±29.61*△ 3.42±0.28* △RHL-HG 9 457.18±30.06*△▲ 2.28±0.21*△▲
MG大鼠腎組織中AT1-R、ACE和 AGT mRNA表達(dá)顯著高于NSG和RHL-LG,而RHL-LG又顯著高于RHLHG(P<0.05),MG和RHL-LG大鼠腎組織中AT2-R mRNA表達(dá)顯著低于NSG和RHL-HG(P<0.05),MG顯著低于RHL-HG,RHL-LG與NSG間無(wú)顯著差異(P>0.05),見圖 3、表 3。
Figure3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1,2 - R,ACE and AGT in rat renal tissue.M:DNA marker;a:RHL - HG;b:RHL-LG;c:MG;d:NSG.圖3 RHL對(duì)大鼠腎組織中AT1,2-R、ACE和AGT mRNA表達(dá)的影響
表3 RHL對(duì)大鼠腎組織中AT1,2-R、ACE和 AGT mRNA表達(dá)的影響Table3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1,2-R,ACE and AGT in rat renal tissues()
表3 RHL對(duì)大鼠腎組織中AT1,2-R、ACE和 AGT mRNA表達(dá)的影響Table3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1,2-R,ACE and AGT in rat renal tissues()
*P<0.05 vs NSG;△P<0.05 vs MG;▲P<0.05 vs RHL-LG.
-actin NSG 10 1.00 ±0.14 1.00 ±0.17 1.00 ±0.13 1.00 ±0.Group n AT1-R/β -actin AT2-R/β -actin ACE/β -actin AGT/β 11 MG 8 1.64 ±0.18* 0.43 ±0.15* 1.94 ±0.16* 1.52 ±0.12*RHL -LG 10 1.13 ±0.09△ 0.68 ±0.07*△ 1.61 ±0.15*△ 1.17 ±0.08△RHL -HG 9 0.71 ±0.13*△▲ 0.98 ±0.18△▲ 1.33 ±0.08*△▲ 0.67 ±0.14*△▲
腎臟疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),現(xiàn)已超過(guò)7%。據(jù)最新資料報(bào)道[4],全球已超過(guò)5億腎臟疾病患者,特別是慢性腎臟疾病已成為繼腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病之后威脅人類健康的重大疾病,目前還沒有充分有效的手段阻止其腎功能進(jìn)行性下降[5]。腎功能衰竭主要病理變化表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)損傷,出現(xiàn)腎小管間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、上皮細(xì)胞變性、壞死、萎縮和間質(zhì)纖維化等。研究表明,腎小管間質(zhì)病變是反映腎功能下降程度以及判斷其轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。以前人們一直認(rèn)為,蛋白尿、血尿素氮和肌酐升高是腎小球疾病的主要臨床表現(xiàn),直接反映腎小球的損傷程度。但隨著腎臟疾病研究的發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識(shí)到這些癥狀不僅是腎小球損傷的生物學(xué)標(biāo)志,而且還是參與腎臟疾病發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立致病因素[5],可直接加速腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷。
RHL具有擴(kuò)張血管和抗高血壓的作用,有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究顯示,經(jīng)尾靜脈注射阿霉素的各組大鼠2周后開始出現(xiàn)蛋白尿,并有BUN和SCr顯著升高,其濃度從2~8周呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。RHL-LG顯著低于MG組,而高于RHL-HG,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢(shì)。腎組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示,與NSG相比,MG組、RHL-LG和RHL-HG大鼠腎小球毛細(xì)血管顯著充血,系膜區(qū)明顯增厚,系膜基質(zhì)顯著增多,足突細(xì)胞明顯肥大。其中RHL-LG的炎癥、系膜區(qū)增厚、系膜基質(zhì)增多以及腎小球充血顯著輕于MG組,腎小球管型明顯少于MG組。而RHL-HG又顯著輕于RHL-LG。這些證據(jù)提示,RHL能減輕阿霉素所致的大鼠腎功能損傷,其作用機(jī)制可能與以下因素有關(guān):(1)RHL增強(qiáng)腎組織中SOD活性與降低MDA含量,維持腎臟組織代謝與功能,阻止腎小管細(xì)胞凋亡:阿霉素?fù)p傷腎小管后,腎臟組織產(chǎn)生氧自由基,直接破壞腎小管膜的多不飽和脂肪酸而誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[7],其反應(yīng)結(jié)果是將活性氧轉(zhuǎn)為非自由基性脂質(zhì)產(chǎn)物,由鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大活性氧效應(yīng),產(chǎn)生MDA、酮基等多種脂質(zhì)過(guò)氧化物[8]。MDA能引起核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)交聯(lián)聚合,產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng),并伴隨細(xì)胞代謝紊亂和功能障礙,最終導(dǎo)致腎小球和腎小管細(xì)胞凋亡[2,9]。因此,MDA含量能直接反映腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化的程度和腎小管細(xì)胞損傷程度。SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶之一,SOD可清除腎臟組織中氧自由基,阻止氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),防止腎小管細(xì)胞損傷。因此,SOD活性可直接反映腎組織清除氧自由基的能力。本研究表明,MG組MDA含量顯著高于RHL-LG,而RHL-LG又顯著高于 RHL-HG;MG組SOD活性顯著低于RHL-LG,而RHL-LG又顯著低于RHLHG。因此,RHL減輕阿霉素致腎功能損傷的作用與增強(qiáng)SOD活性和抑制MDA的生成,從而改善腎組織的代謝功能,減少腎小管細(xì)胞凋亡有關(guān)。(2)RHL調(diào)控腎組織中AT1,2-R、ACE和 AGT mRNA表達(dá),增加腎組織血流量,減輕腎小管纖維化:腎素-血管緊張素系統(tǒng)是重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng),其主要家族成員為:腎素、AGT、ACE、AngⅠ、AngⅡ、AT1,2- R及醛固酮(aldosterone,ALD)等。腎素使AGT轉(zhuǎn)化為AngⅠ,AngⅠ在ACE作用下轉(zhuǎn)變?yōu)锳ngⅡ,AngⅡ與AT1-R結(jié)合促使血管收縮,促進(jìn)ALD分泌,增強(qiáng)鈉、水潴留,持續(xù)升高血壓。另一方面,AngⅡ作用于AT2-R,激活NO合酶活性、促進(jìn)NO的合成[10-11]。而NO是一種不穩(wěn)定的自由基,是一種新型生物信使分子,具有松弛平滑肌、抑制血小板黏附和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),調(diào)節(jié)局部組織血流量,降低血壓,抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移的作用[12-13]。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MG組AT1-R、ACE和AGT mRNA表達(dá)顯著高于RHL-LG,而RHL-LG又顯著高于RHL-HG;MG組和RHL-LG腎組織中AT2-R mRNA表達(dá)顯著低于RHL-HG治療組;其中,MG組顯著低于RHL-LG治療組,表明RHL抑制AT1-R、ACE和AGT mRNA表達(dá)而上調(diào)AT2-R mRNA表達(dá)。這與有關(guān)報(bào)道的RHL能抑制ACE活性、減少AngⅡ的生成[14]、增強(qiáng)腎性高血壓大鼠NO/eNOS系統(tǒng)的報(bào)道一致[15]。因此,RHL改善阿霉素大鼠腎功能的機(jī)制可能與其抑制腎組織中AT1-R、ACE和AGT mRNA表達(dá),上調(diào)AT2-R mRNA表達(dá),增加腎組織血流量有關(guān)。
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