龍吉美，黃德彬，李魁武，羅 瓊

(1湖北省建始縣人民醫(yī)院，湖北 建始 445300;2湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

鉤藤堿(rhynchophylline，RHL)系茜草科植物鉤藤[Uncaria rhynchophylla(Miq.)Jackson]的主要成分。鉤藤水提取物具有息風(fēng)定驚、清熱平肝等功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，RHL具有保護(hù)腦缺血再灌注所致的腦損傷作用，還具有顯著的鈣拮抗、抑制心肌重構(gòu)、降低血壓、抗心律失常等作用[2]。臨床用于治療高血壓、支氣管哮喘、癲癇等疾病[3]。有研究報(bào)道，鉤藤堿和異鉤藤堿能顯著抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)所導(dǎo)致的血管重塑[3]，其機(jī)制與下調(diào)NF－κB蛋白表達(dá)及抑制c－myc、c－fos基因mRNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)[2]。我們研究發(fā)現(xiàn)鉤藤堿具有改善阿霉素腎病大鼠腎功能的作用，其機(jī)制與增強(qiáng)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，減少丙二醛(malondialdehyde，MDA)生成，調(diào)控腎組織血管緊張素受體1、2(angiotensin receptors 1，2，AT1，2－ R)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin － converting enzyme，ACE)和 血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)mRNA表達(dá)等相關(guān)。但RHL對(duì)阿霉素腎病大鼠腎損傷的作用尚不清楚，本研究觀察RHL對(duì)阿霉素致大鼠腎功能損傷的作用并探討其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)成年雌性SD大鼠52只，體重 (180±20)g(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4110817)。分籠飼養(yǎng)(每籠3～4只)，溫度維持在(25±3)℃，相對(duì)濕度(55±15)%，按光照與黑暗每天12 h輪替。飼料與飲水均經(jīng)滅菌處理。

1.2 器材 大鼠代謝籠(M－5，1410 mm×400 mm×1550 mm，上海中勝科教設(shè)備有限公司);全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)思博名科學(xué)器材公司);石蠟包埋機(jī)(EG1150－H);切片機(jī)(RM2245);全自動(dòng)組織脫水機(jī)和顯微鏡(DM2000);全自動(dòng)顯微鏡數(shù)碼攝像系統(tǒng)(Olympus);電子分析天平(Sartorius);3K30型低溫高速離心機(jī)(Sigma);超純水裝置(Millipore);Du－7500紫外分光光度計(jì)(Beckman);TP600型PCR基因擴(kuò)增儀(TaKaRa);電泳儀及電泳槽(江蘇儀器廠);LG2020D型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司);F200酶標(biāo)儀(帝肯);微量加樣器(Gilson)。

1.3 主要試劑 水合氯醛(上海金貿(mào)泰化工有限公司);鉤藤堿(RHL，Sigma);阿霉素(adriamycin，ADR，Sigma);SOD 和MDA檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，NBT法和TBA法);伊紅、蘇木素、多聚賴氨酸、S－P試劑盒及DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司);PCR引物和DL2000 DNA marker(大連寶生物工程公司);PV6001二步法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋);Trizol Reagent和引物核苷酸片段(Invitrogen);M－MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega);瓊脂糖(Promega);PCR Mix試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與處理 隨機(jī)將大鼠分成4組，即生理鹽水組(NSG，n=10)、模型組(MG，n=14)、鉤藤堿低劑量治療組(RHL－LG，n=14)和高劑量治療組(RHL－HG，n=14)。MG、RHL－LG和RHL－HG經(jīng)尾靜脈注射阿霉素(5 mg·kg－1)制造腎病模型，NSG注射等容量生理鹽水(NS)。2周后檢測(cè)尿蛋白含量為(+++)者納入腎病模型實(shí)驗(yàn)(比例為65%)，MG、RHL－LG和 RHL－HG分別為8只、10只和9只。各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，RHL－LG和RHL－HG分別給予腹腔注射 RHL 5mg·kg－1和 15 mg·kg－1[4]，NSG、MG分別給予腹腔注射等容量NS，共治療8周。

2.2 標(biāo)本收集

2.2.1 血液標(biāo)本采集 自眼眶靜脈叢采血。先按壓大鼠頸部?jī)蓚?cè)，讓眼眶靜脈叢充分充血，以毛細(xì)玻璃管自眼內(nèi)角呈45°角刺入，采集血液約 1～2 mL，室溫靜置 15 min，4 ℃、3000 r/min離心15 min，吸取血清，以生化指標(biāo)檢測(cè)備用。

2.2.2 尿液的收集 用代謝籠采集尿液標(biāo)本。分別于0周、2周、4周、6周、8周的最后1 d收集24 h尿液標(biāo)本，測(cè)量24 h尿量，吸取尿液，25℃、1000 r/min離心10 min后，取上清液放入－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 腎組織標(biāo)本采集 動(dòng)物處死前，以水合氯醛(10%，3mg/kg)腹腔麻醉，迅速摘下右腎置入液氮保存?zhèn)溆?。左腎以4%多聚甲醛固定，HE染色、免疫組化染色備用。

2.3 標(biāo)本檢測(cè)

2.3.1 生化指標(biāo)檢測(cè) 以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清和尿液中總蛋白、白蛋白、血清肌酐(serum creatinine，SCr)及血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)等指標(biāo)。24 h尿蛋白定量計(jì)算方法[5]:24 h尿蛋白定量(mg/d)=尿蛋白濃度(mg/L)×24 h尿量(L)。

2.3.2 MDA含量與SOD活性分析 嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明書用試劑盒檢測(cè)MDA含量和SOD活性，簡(jiǎn)要地說(shuō)，就是用勻漿機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝組織勻漿，取上清液樣品用于MDA含量和SOD活性分析，在586 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)檢測(cè)MDA含量 和SOD活性。

2.3.3 病理學(xué)檢測(cè)(HE染色) 以10%甲醛固定24 h，經(jīng)梯度乙醇(70%、80%、95%、100%)脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明處理，常規(guī)浸蠟包埋，脫蠟，蘇木素染核，分化，反藍(lán)，脫水，中性樹膠封固。

2.3.4 RT － PCR 檢測(cè) AT1，2－ R、ACE 及 AGT mRNA 表達(dá)按文獻(xiàn)[6]用RT－PCR法半定量分析各自mRNA水平(用Trizol試劑提取腎組織總RNA)。取100 mg液氮凍存腎組織研磨，加入Trizol 1 mL，用勻漿器勻漿，25℃孵育10 min。4℃、12000×g離心5 min，棄沉淀。吸取上清液加入新離心管，加入氯仿200 μL，混勻，于 25℃靜置 5 min，再離心 15 min(12000×g、4℃)。吸取上清液，加入另一離心管，加入0.5 mL異丙醇，25℃靜置10 min。繼續(xù)離心10 min(4℃、12000×g)，去除上清液，以乙醇洗滌RNA沉淀(75%，1 mL)，混均勻。離心5 min(4℃、80000×g)，棄上清。再漂洗沉淀，25℃晾干，沉淀 RNA 10 min。用 30～50 μL RNase－free ddH2O溶解沉淀，55℃水浴助溶10 min，漩渦混勻30 s，離心(4℃、120000×g)，得到上清RNA樣品。

RT反應(yīng):取5 μL加入DEPC處理的45 μL無(wú)菌水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量A值檢測(cè)RNA(A260/A280在1.8～2.0為純度合格)。另取5 μL，以瓊脂糖甲醛變性膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行鑒定，余下部分于－85℃冰箱保存?zhèn)溆?。按AMV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書進(jìn)行第一鏈cDNA合成。取AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，5×RT 反應(yīng)緩沖液4 μL，dNTP 混合物4 μL(每種2.5 mmol/L)，Oligo dT15Primers 2 μL(50 μmol/L)，總 RNA 2 μg，最后加入適量RNase－free ddH2O至總體積達(dá)20 μL。將混合物置10 min(25℃)，置入水浴孵育1 h(42℃)得cDNA，吸取cDNA 2 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng):2 μL cDNA，12.5 μL 2 × Taq Master，10 pmol相應(yīng)引物，加入適量ddH2O至25 μL。吸取10 μL擴(kuò)增物，用瓊脂糖凝膠(2%)行DNA電泳，Tanon－1600 Figure Gel凝膠成像系統(tǒng)拍照，以軟件GIS1D Gel Image System分析條帶吸光度(A值)，結(jié)果以目的基因和β－actin A值比值表示。其引物序列如下:AT1－R上游引物5'－GCACAATCGCCATAATTATCC －3'，下游引物 5'－ CACCTATGTAAGATCGCTTC －3'，擴(kuò)增片段445 bp，退火溫度53℃;AT2－R上游引物5'－GTGTCCAGCATTTACATCTTCA －3'，下游引物 5'－CACCAAACAAGGGGAACTAC－3'，擴(kuò)增片段275 bp，退火溫度，55℃;ACE 上游引物5'－GCAGAACTTCACTGACCAAAAG －3'，下游引物5'－TCAAAGGAGGGGGACTCATA－3'，擴(kuò)增片段 383 bp，退火溫度55℃;AGT上游引物5'－TTGTTGAGAGCTTGGGTCCCTTCA－3'，下游引物 5'－CAGACACTGAGGTGCTGTTGTCCA－3'，擴(kuò)增片段265 bp，退火溫度60℃;β－actin上游引物5'－GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT－3'，下游引物5'－AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC －3'，擴(kuò)增片段617 bp，退火溫度55℃。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 RHL對(duì)大鼠24 h尿蛋白的影響

MG、RHL－LG和RHL－HG經(jīng)尾靜脈注射阿霉素2周后出現(xiàn)蛋白尿，顯著高于NSG(P＜0.05)，表明急性腎功能衰竭模型制造成功。24 h尿蛋白含量從2～8周呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。RHL－LG顯著低于MG，而高于RHL－HG(P＜0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢(shì)，見圖1。

Figure1.Effect of RHL on 24 h urine protein in rats.*P ＜0.05vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P＜0.05 vs RHL－LG.圖1 RHL對(duì)大鼠24 h尿蛋白的影響

2 RHL對(duì)大鼠血清中BUN和SCr含量的影響

MG、RHL－LG和RHL－HG血清中BUN和SCr顯著高于NSG(P＜0.05)，表明急性腎功能衰竭模型制造成功。其中，RHL－LG血清中的BUN和SCr顯著低于MG，而高于RHL－HG(P＜0.05)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢(shì)，見表1。

表1 RHL對(duì)大鼠血清中BUN和SCr含量的影響Table1.Effects of RHL on BUN and SCr in rats()

表1 RHL對(duì)大鼠血清中BUN和SCr含量的影響Table1.Effects of RHL on BUN and SCr in rats()

*P＜0.05 vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P＜0.05 vs RHLLG.

Group n BUN(mmol/L) SCr(μmol/L)NSG 10 7.93 ±1.67 31.58 ±2.06 MG 8 23.43 ±2.54* 56.84 ±3.25*RHL － LG 10 16.95 ±1.83＊△ 44.15 ±2.76＊△RHL － HG 9 10.17 ±1.37＊△▲ 37.92 ±3.71＊△▲

3 RHL對(duì)大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響

與NSG相比，MG、RHL－LG和RHL－HG大鼠腎小球毛細(xì)血管顯著充血，系膜區(qū)明顯增厚，系膜基質(zhì)顯著增多，足突細(xì)胞明顯肥大。RHL－LG的炎癥、系膜區(qū)增厚和系膜基質(zhì)增多明顯輕于MG，腎小球充血及腎小球管型明顯少于MG。而RHL－HG的病理改變又顯著輕于RHL－LG，見圖2。

Figure2.Effects of RHL on the morphology of rat renal tissues(HE staining，×400).圖2 RHL對(duì)大鼠腎組織形態(tài)學(xué)的影響

4 RHL對(duì)大鼠腎組織中SOD活性及MDA含量的影響

MG、RHL－LG和RHL－HG大鼠腎組織中SOD活性顯著低于NSG(P＜0.05);MG顯著低于RHL－LG，而RHLLG又明顯低于 RHL－HG(P＜0.05)。MG、RHL－LG和RHL－HG大鼠腎組織中 MDA含量顯著高于 NSG(P＜0.05);MG顯著高于 RHL－LG，而RHL－LG又明顯高于RHL－HG(P＜0.05)，見表2。

表2 RHL對(duì)大鼠腎組織中SOD活性與MDA含量的影響Table2.Effects of RHL on SOD activity and MDA content in rat renal tissues()

表2 RHL對(duì)大鼠腎組織中SOD活性與MDA含量的影響Table2.Effects of RHL on SOD activity and MDA content in rat renal tissues()

*P＜0.05 vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P ＜0.05 vs RHL－LG.

Group n SOD[μmol/(g protein)]MDA[μmol/(g protein )]NSG 10 533.62±27.71 1.37±0.25 MG 8 297.54±21.57* 4.08±0.41*RHL－LG 10 379.46±29.61＊△ 3.42±0.28＊ △RHL－HG 9 457.18±30.06＊△▲ 2.28±0.21＊△▲

5 RHL對(duì)大鼠腎組織中AT1，2－R、ACE和AGT mRNA表達(dá)的影響

MG大鼠腎組織中AT1－R、ACE和 AGT mRNA表達(dá)顯著高于NSG和RHL－LG，而RHL－LG又顯著高于RHLHG(P＜0.05)，MG和RHL－LG大鼠腎組織中AT2－R mRNA表達(dá)顯著低于NSG和RHL－HG(P＜0.05)，MG顯著低于RHL－HG，RHL－LG與NSG間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見圖 3、表 3。

Figure3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1，2 － R，ACE and AGT in rat renal tissue.M:DNA marker;a:RHL － HG;b:RHL－LG;c:MG;d:NSG.圖3 RHL對(duì)大鼠腎組織中AT1，2－R、ACE和AGT mRNA表達(dá)的影響

表3 RHL對(duì)大鼠腎組織中AT1，2－R、ACE和 AGT mRNA表達(dá)的影響Table3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1，2－R，ACE and AGT in rat renal tissues()

表3 RHL對(duì)大鼠腎組織中AT1，2－R、ACE和 AGT mRNA表達(dá)的影響Table3.Effects of RHL on the mRNA expression of AT1，2－R，ACE and AGT in rat renal tissues()

*P＜0.05 vs NSG;△P＜0.05 vs MG;▲P＜0.05 vs RHL－LG.

－actin NSG 10 1.00 ±0.14 1.00 ±0.17 1.00 ±0.13 1.00 ±0.Group n AT1－R/β －actin AT2－R/β －actin ACE/β －actin AGT/β 11 MG 8 1.64 ±0.18* 0.43 ±0.15* 1.94 ±0.16* 1.52 ±0.12*RHL －LG 10 1.13 ±0.09△ 0.68 ±0.07＊△ 1.61 ±0.15＊△ 1.17 ±0.08△RHL －HG 9 0.71 ±0.13＊△▲ 0.98 ±0.18△▲ 1.33 ±0.08＊△▲ 0.67 ±0.14＊△▲

討 論

腎臟疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，現(xiàn)已超過(guò)7%。據(jù)最新資料報(bào)道[4]，全球已超過(guò)5億腎臟疾病患者，特別是慢性腎臟疾病已成為繼腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病之后威脅人類健康的重大疾病，目前還沒有充分有效的手段阻止其腎功能進(jìn)行性下降[5]。腎功能衰竭主要病理變化表現(xiàn)為腎小管間質(zhì)損傷，出現(xiàn)腎小管間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、上皮細(xì)胞變性、壞死、萎縮和間質(zhì)纖維化等。研究表明，腎小管間質(zhì)病變是反映腎功能下降程度以及判斷其轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵指標(biāo)[6]。以前人們一直認(rèn)為，蛋白尿、血尿素氮和肌酐升高是腎小球疾病的主要臨床表現(xiàn)，直接反映腎小球的損傷程度。但隨著腎臟疾病研究的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到這些癥狀不僅是腎小球損傷的生物學(xué)標(biāo)志，而且還是參與腎臟疾病發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立致病因素[5]，可直接加速腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷。

RHL具有擴(kuò)張血管和抗高血壓的作用，有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究顯示，經(jīng)尾靜脈注射阿霉素的各組大鼠2周后開始出現(xiàn)蛋白尿，并有BUN和SCr顯著升高，其濃度從2～8周呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。RHL－LG顯著低于MG組，而高于RHL－HG，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴趨勢(shì)。腎組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，與NSG相比，MG組、RHL－LG和RHL－HG大鼠腎小球毛細(xì)血管顯著充血，系膜區(qū)明顯增厚，系膜基質(zhì)顯著增多，足突細(xì)胞明顯肥大。其中RHL－LG的炎癥、系膜區(qū)增厚、系膜基質(zhì)增多以及腎小球充血顯著輕于MG組，腎小球管型明顯少于MG組。而RHL－HG又顯著輕于RHL－LG。這些證據(jù)提示，RHL能減輕阿霉素所致的大鼠腎功能損傷，其作用機(jī)制可能與以下因素有關(guān):(1)RHL增強(qiáng)腎組織中SOD活性與降低MDA含量，維持腎臟組織代謝與功能，阻止腎小管細(xì)胞凋亡:阿霉素?fù)p傷腎小管后，腎臟組織產(chǎn)生氧自由基，直接破壞腎小管膜的多不飽和脂肪酸而誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[7]，其反應(yīng)結(jié)果是將活性氧轉(zhuǎn)為非自由基性脂質(zhì)產(chǎn)物，由鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大活性氧效應(yīng)，產(chǎn)生MDA、酮基等多種脂質(zhì)過(guò)氧化物[8]。MDA能引起核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，并伴隨細(xì)胞代謝紊亂和功能障礙，最終導(dǎo)致腎小球和腎小管細(xì)胞凋亡[2，9]。因此，MDA含量能直接反映腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化的程度和腎小管細(xì)胞損傷程度。SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，SOD可清除腎臟組織中氧自由基，阻止氧自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，防止腎小管細(xì)胞損傷。因此，SOD活性可直接反映腎組織清除氧自由基的能力。本研究表明，MG組MDA含量顯著高于RHL－LG，而RHL－LG又顯著高于 RHL－HG;MG組SOD活性顯著低于RHL－LG，而RHL－LG又顯著低于RHLHG。因此，RHL減輕阿霉素致腎功能損傷的作用與增強(qiáng)SOD活性和抑制MDA的生成，從而改善腎組織的代謝功能，減少腎小管細(xì)胞凋亡有關(guān)。(2)RHL調(diào)控腎組織中AT1，2－R、ACE和 AGT mRNA表達(dá)，增加腎組織血流量，減輕腎小管纖維化:腎素－血管緊張素系統(tǒng)是重要的血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其主要家族成員為:腎素、AGT、ACE、AngⅠ、AngⅡ、AT1，2－ R及醛固酮(aldosterone，ALD)等。腎素使AGT轉(zhuǎn)化為AngⅠ，AngⅠ在ACE作用下轉(zhuǎn)變?yōu)锳ngⅡ，AngⅡ與AT1－R結(jié)合促使血管收縮，促進(jìn)ALD分泌，增強(qiáng)鈉、水潴留，持續(xù)升高血壓。另一方面，AngⅡ作用于AT2－R，激活NO合酶活性、促進(jìn)NO的合成[10－11]。而NO是一種不穩(wěn)定的自由基，是一種新型生物信使分子，具有松弛平滑肌、抑制血小板黏附和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)局部組織血流量，降低血壓，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷移的作用[12－13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MG組AT1－R、ACE和AGT mRNA表達(dá)顯著高于RHL－LG，而RHL－LG又顯著高于RHL－HG;MG組和RHL－LG腎組織中AT2－R mRNA表達(dá)顯著低于RHL－HG治療組;其中，MG組顯著低于RHL－LG治療組，表明RHL抑制AT1－R、ACE和AGT mRNA表達(dá)而上調(diào)AT2－R mRNA表達(dá)。這與有關(guān)報(bào)道的RHL能抑制ACE活性、減少AngⅡ的生成[14]、增強(qiáng)腎性高血壓大鼠NO/eNOS系統(tǒng)的報(bào)道一致[15]。因此，RHL改善阿霉素大鼠腎功能的機(jī)制可能與其抑制腎組織中AT1－R、ACE和AGT mRNA表達(dá)，上調(diào)AT2－R mRNA表達(dá)，增加腎組織血流量有關(guān)。

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