肖定璋，陳少賢，陳 景，羅 瓊，黃曙方，丁 紅

(廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院1醫(yī)學(xué)研究中心，2血液科，廣東 廣州 510080)

巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migrationinhibitory factor，MIF)是長期進(jìn)化中的一個保守蛋白質(zhì)，分子量約12.5 kD，于1966年被發(fā)現(xiàn)，是最早被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子之一。MIF最初被認(rèn)為由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制巨噬細(xì)胞遷移的作用[1]，在細(xì)胞免疫，特別是在遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)方面具有重要作用。MIF是一種多效的促炎因子，在病理條件下加劇炎癥進(jìn)程，因此MIF在內(nèi)毒素休克、結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、胰腺炎等急慢性炎癥中具有重要作用。隨后發(fā)現(xiàn)，MIF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等方面也起著重要作用。

1989年，MIF從T淋巴細(xì)胞中被克隆出來，此后對MIF分子結(jié)構(gòu)及功能活性的研究有了進(jìn)一步發(fā)展?，F(xiàn)在已明確MIF不僅由T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其它免疫細(xì)胞、一些內(nèi)分泌細(xì)胞和實(shí)質(zhì)性細(xì)胞均能表達(dá)和分泌MIF[2]。近年來發(fā)現(xiàn)，MIF往往表現(xiàn)出內(nèi)分泌特性及酶活性，其獨(dú)特的巰基蛋白質(zhì)氧化還原酶(thiol－protein oxidoreductase，TPOR)催化活性出現(xiàn)在第57～60位的Cys－Ala－Leu－Cys氨基酸殘基上。該活性中心2個半胱氨酸殘基在游離的巰基(S－H)和二硫鍵(S－S)形式之間不斷轉(zhuǎn)化，形成可逆性氧化還原反應(yīng)。這是典型的硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)家族中的巰基蛋白質(zhì)氧化還原反應(yīng)。因此，MIF具有二硫化物還原酶的活性[3]。結(jié)構(gòu)與功能的研究表明，MIF的酶活性關(guān)系到細(xì)胞內(nèi)的氧化－還原內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、細(xì)胞的凋亡抑制、單核－巨噬細(xì)胞的活化、MIF結(jié)合蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。MIF氧化還原機(jī)制的研究，可以從根本上推動MIF在炎癥、腫瘤及心血管方面的研究。

酵母菌株 L40 [MATa，trp1，leu2，his3，URA3::(lexAop)8－lacZ，LYS2::(lexAop)4－HIS3，lys2，ura3，ade2，gal80，gal4]，由于存在 trp1、leu2 和 his3 基因突變，所以不能在缺乏Trp、Leu和His的 SD培養(yǎng)基(synthetic defined medium)上生長。pBTM116載體4.8 kb，含有 LexA DNA編碼序列(binding domain，BD)及酵母Trp1基因，當(dāng)L40酵母菌被pBTM116成功轉(zhuǎn)化后，便能在無 Trp的 SD培養(yǎng)基上生長。pBTM116載體表達(dá)的外源基因必須與BD形成融合蛋白。pACT2載體8.1 kb，含有GAL4編碼序列(activating domain，AD)及酵母 Leu2基因，當(dāng) L40被pACT2成功轉(zhuǎn)化后，便能在無Leu的SD培養(yǎng)基上生長。pACT2載體表達(dá)的外源基因必須與AD形成融合蛋白。L40酵母菌含有2個由LexA啟動子驅(qū)動的報告基因 HIS3和lacZ，當(dāng)L40同時被 pBTM116與pACT2成功轉(zhuǎn)化后，如果誘餌蛋白(BD)與文庫中的蛋白(AD)發(fā)生結(jié)合時，BD和AD便能進(jìn)入細(xì)胞核中，BD片段與LexA啟動子序列結(jié)合，BD片段起到募集RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄激活作用，導(dǎo)致下游報告基因HIS3和lacZ表達(dá)。此時L40便可在多重選擇性SD培養(yǎng)基(同時缺乏Trp、Leu及His)上生長，通過β－半乳糖苷酶(β－galactosidase)實(shí)驗(yàn)，可篩選出與MIF催化TPOR活性片段有相互作用的cDNA文庫序列。

本研究采用 MIF催化 TPOR活性域，構(gòu)建pBTM116－MIF誘餌質(zhì)粒。通過酵母雙雜交技術(shù)大規(guī)模篩選，發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白樣蛋白2(thioredoxinlike 2 protin，TXNL2)可與MIF催化 TPOR活性片段發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。進(jìn)一步通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，證實(shí)野生型MIF(wtMIF)與TXNL2的相互作用，并通過免疫熒光共定位分析，發(fā)現(xiàn)Myc－TXNL2與MIF在細(xì)胞質(zhì)中分布位置相同。TXNL2與MIF相互作用將為MIF氧化還原機(jī)制的研究提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α購自TaKaRa。人MIF基因由本單位單志新惠贈[4]。pcDNA3.1－Myc表達(dá)載體、酵母菌株L40、pBTM116載體、pACT2載體及人骨肉瘤(osteosarcoma)pACT2－cDNA文庫均由加拿大McGill University Dr.Moulay Alaoui－Jamali惠贈。

1.2 試劑與材料 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ和Pfu聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa;質(zhì)粒小提試劑盒購自上海Tiangen;質(zhì)粒純化試劑盒購自Qiagen;PCR引物合成及序列測定，由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。DNA marker DL2000購自TaKa-Ra。蛋白預(yù)染marker購自Fermentas。丙烯酰胺、N，N’－亞甲基雙丙烯酰胺和TEMED均購自Sigma。Anti－MIF(sc－20121)及 anti－GAPDH(sc－166545)抗體均購自 Santa Cruz，anti－Myc(sc－40)抗體購自Cell Signaling。選擇性培養(yǎng)基DO supplement－ Trp(Cat.630413)、DO supplement－ Leu/－ Trp(Cat.630417)、DO supplement－ His/－ Leu/－ Trp(Cat.630419)以及酵母轉(zhuǎn)化試劑(PEG/LiAC)均購自Clontech。

2 方法

2.1 pBTM116－MIF誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建 構(gòu)建表達(dá)含人MIF基因催化TPOR活性區(qū)域Cys－Ala－Leu－Cys的誘餌質(zhì)粒pBTM116－MIF:根據(jù)GenBank發(fā)表的人MIF基因(NM_002415)，采用PCR技術(shù)，以我們已有的人MIF全長cDNA質(zhì)粒為模版，PCR擴(kuò)增含MIF基因催化TPOR活性域的片段，根據(jù)讀碼框架，將其構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pBTM116質(zhì)粒上，獲得pBTM116－MIF誘餌質(zhì)粒。在MIF50－65兩端設(shè)計引物。pBTM116－MIF上游引物5’－atatgaattcgccttcggcggctccagcga－3’，下游引物5’－atatgtcgacactagccgatgctgtgcaggct－3’。獲得含 MIF基因催化 TPOR活性區(qū)域的片段，約70 bp。

2.2 連接、轉(zhuǎn)化及酶切鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，回收純化目的片段DNA，PCR產(chǎn)物與pBTM116載體分別用EcoR I和Sal I進(jìn)行雙酶切。純化酶切產(chǎn)物，于16℃用 T4 DNA連接酶將目的片段和pBTM116載體進(jìn)行連接反應(yīng)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH－5α感受態(tài)菌。挑取陽性細(xì)菌克隆，接種于氨芐青霉素+LB培養(yǎng)液中，置37℃振搖培養(yǎng)擴(kuò)增。取2mL菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切鑒定，篩選陽性克隆。挑取酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒接種于氨芐青霉素+LB培養(yǎng)液中，置37℃振搖培養(yǎng)，大量擴(kuò)增。酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒命名為pBTM116－MIF。純化所構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序正確后，用于轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞。

2.3 CDS序列和氨基酸序列比較 將測序所得序列在GenBank上與人MIF基因序列(NM_002415)進(jìn)行BLAST比較分析，證明插入的MIF序列與pBTM116－LexA讀碼框架一致。

2.4 誘餌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選 采用順序轉(zhuǎn)染篩選法。首先將上述所構(gòu)建的pBTM116－MIF質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)酵母菌L40，在二重選擇性培養(yǎng)基上篩選出成功轉(zhuǎn)化了pBTM116－MIF50－65質(zhì)粒的酵母菌。根據(jù) Clontech’s Matchmaker操作方法進(jìn)行。將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化L40酵母細(xì)胞株，篩選被轉(zhuǎn)化的酵母菌株，最后接種于SD－Trp瓊脂培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)數(shù)天，獲得轉(zhuǎn)化了pBTM116－MIF50－65的L40酵母菌克隆。

2.5 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn) 將上述L40－MIF酵母菌株制備為感受態(tài)菌，方法同上。擴(kuò)增人骨肉瘤pACT2－cDNA文庫，將其轉(zhuǎn)化上述制備的酵母感受態(tài)菌中。轉(zhuǎn)染效率反映被篩選的克隆數(shù)量，至少應(yīng)大于1×106，才具有文庫代表性。接種于含有25 mmol/L 3－氨基－1，2，4－三氧唑(3－amino－1，2，4－triazole，3－AT;Sigma，#A －8056)的 SD －Trp－Leu－His(tryptophan－leucine－h(huán)istidine)三重選擇性瓊脂培養(yǎng)板上。使用3－AT目的是降低非特異結(jié)合背景。最后獲得可在SD－Trp－Leu－His三重選擇性培養(yǎng)基上生長的L40酵母轉(zhuǎn)化菌落，同時通過β－半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)篩選鑒定(同下述)，選擇陽性克隆。

2.6 lacZ報告基因活性分析及β－半乳糖苷酶反應(yīng)

將三重選擇性培養(yǎng)基上生長的陽性酵母菌克隆分離擴(kuò)增，分離出其中所攜帶的pACT2質(zhì)粒。采用電轉(zhuǎn)染方法將所獲的pACT2質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH－5α，大量擴(kuò)增該質(zhì)粒。將所獲的pACT2質(zhì)粒與前面構(gòu)建的pBTM116－MIF質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染L40酵母菌，對照組為pACT2質(zhì)粒與pBTM116空載體共轉(zhuǎn)染，確認(rèn)pACT2載體所表達(dá)的蛋白確是與pBTM116－MIF重組質(zhì)粒表達(dá)的MIF催化TPOR活性區(qū)域蛋白特異性結(jié)合，而不是與pBTM116空載體的非特異性結(jié)合。

當(dāng)宿主酵母菌同時轉(zhuǎn)染pBTM116重組質(zhì)粒與pACT2質(zhì)粒，且 pBTM116重組質(zhì)粒表達(dá)的催化TPOR活性區(qū)域蛋白(Bait)與pACT2質(zhì)粒表達(dá)的靶蛋白發(fā)生相互作用時，激活酵母報告基因表達(dá)β－半乳糖苷酶，從而在lacZ實(shí)驗(yàn)中見到藍(lán)斑。根據(jù)Clontech’s Matchmaker操作方法，采用鄰硝基苯－β－D－半乳糖苷(o－nitrophenyl β－D－galactopyranoside，ONPG)為底物，以液氮反復(fù)凍融破碎酵母細(xì)胞壁，檢測β－半乳糖苷酶活性。

2.7 pACT2－cDNA文庫篩選與分離 根據(jù)Clontech’s Matchmaker操作方法，分離獲得與MIF催化TPOR活性區(qū)域蛋白相互作用的蛋白。簡述之:擴(kuò)增β－半乳糖苷酶反應(yīng)陽性克隆，加入酵母菌裂解液(2%Triton X － 100，1%SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA)，加入等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，加入酸洗玻璃珠(Sigma，#G－8772)，反復(fù)振蕩破碎酵母細(xì)胞壁。離心取上清，以乙醇沉淀法回收DNA。將所獲DNA轉(zhuǎn)染DH－5α感受態(tài)菌，方法同上。挑取陽性細(xì)菌克隆，篩選pACT2－cDNA陽性克隆。方法同上。pACT2－cDNA陽性克隆質(zhì)粒擴(kuò)增、純化、測序﹑氨基酸讀碼框架檢測及BLAST分析，方法同上。根據(jù)pACT2載體圖譜資料，在其N端設(shè)計PCR引物即可進(jìn)行測序。

2.8 pcDNA3.1－Myc－TXNL2質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank發(fā)表的人TXNL2基因mRNA(NM_006541)，以人骨肉瘤cDNA文庫為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得人TXNL2全長cDNA。隨后將其克隆到pcDNA3.1－Myc載體上，并與Myc標(biāo)簽基因讀碼框架保持一致。Myc－TXNL2表達(dá)形成融合蛋白，具體構(gòu)建方法同上。

pcDNA3.1－Myc上游引物5’－atatgcggccgcagcatggcggcgggggc－3’，下游引物 5’－agagtctagattaattttctcctctcag－3’。為了便于隨后的定向克隆和表達(dá)產(chǎn)物的檢測，在上游引物5'端添加限制性內(nèi)切酶Not I識別序列(下劃線)，在下游引物添加限制性內(nèi)切酶Xba I識別序列(下劃線)，獲得擴(kuò)增片段大小約為900 bp的人TXNL2活性片段。

2.9 制備用于哺乳細(xì)胞轉(zhuǎn)染的純化質(zhì)粒DNA 采用質(zhì)粒大提純化試劑盒(Qiagen Plasmid Maxi Kit 12163)，按照操作說明制備高純度質(zhì)粒DNA。

2.10 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將MCF－7細(xì)胞接種到6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至約80%融合時，采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按Invitrogen脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，將上述構(gòu)建的pcDNA3.1－Myc－TXNL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF－7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染完成后輕輕混勻后置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h。

2.11 Western blotting檢測重組蛋白Myc－TXNL2及其它相關(guān)蛋白的表達(dá) 將轉(zhuǎn)染完成的MCF－7細(xì)胞株輕輕混勻后置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h。同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1－Myc空載體作為對照。裂解細(xì)胞收集總蛋白、檢測蛋白濃度、12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移PVDF膜。5%脫脂奶粉的TTBS室溫封閉1～2 h，TTBS漂洗5 min×3次。分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗溶液(anti－Myc、anti－MIF和 anti－GAPDH)，4℃孵育過夜。TTBS漂洗5 min×3次。加入相應(yīng)的Ⅱ抗溶液，4℃孵育45 min。TTBS漂洗5 min×3次。ECL顯影、曝光。

2.12 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 將pcDNA3.1－Myc－TXNL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF－7細(xì)胞，方法同上。轉(zhuǎn)染后48 h收獲細(xì)胞，提取總蛋白。將2 μg anti－MIF抗體加入到600 μg蛋白抽提液中(根據(jù) Bradford assay)，4℃緩慢顛倒孵育3 h;取25 μL protein A/protein G瓊脂糖珠，用1 mL緩沖液洗3次，每次以10000×g離心1 min。將預(yù)處理好的瓊脂糖珠加入到和抗體孵育后的細(xì)胞總蛋白溶液中，4℃緩慢顛倒孵育1 h。4℃以10000×g速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底;將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 mL緩沖液洗5次;最后加入15 μL 2×SDS上樣緩沖液，加熱變性5 min。Western blotting分析，方法同上。對照組加入與MIF抗體等量的Rabbit IgG，其它同實(shí)驗(yàn)組。

2.13 免疫熒光共定位分析 轉(zhuǎn)染細(xì)胞、制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長至70%融合后，去除培養(yǎng)液，PBS(pH 7.4)洗3次，加入4%多聚甲醛溶液室溫下固定15 min，隨后加入預(yù)冷的甲醇(－80℃)，置－20℃固定10 min。再用PBS洗滌3次，每次5 min;加入封閉用PBS(含2%BSA、2%正常羊血清、0.2% 明膠)，室溫中孵育封閉1 h。加入MIF和Myc抗體，4℃孵育過夜。用含2%BSA的PBS清洗3次，每次5 min;再用連接有德克薩斯紅(Texas Red，Jackson ImmunoResearch)的羊抗兔和羊抗鼠抗體(Alexa Fluor 555)室溫孵育30 min。PBS洗滌3次，每次5 min(避光操作)，加入 Hoechst 33342(1∶1000 稀釋，Gigma)室溫染1 min。PBS清洗3次(避光操作)后用水溶性封片劑(50%甘油)封片，激光共聚焦顯微鏡(Leica，SP5－FCS)觀察、拍照。

結(jié) 果

1 pBTM116－MIF誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切鑒定

重組誘餌質(zhì)粒pBTM116－MIF經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切后，經(jīng)20%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，約在70 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，片段大小與預(yù)期值相符，無非特異性擴(kuò)增帶，判斷此條帶為人MIF催化TPOR活性區(qū)域目的條帶;而空載體pBTM116未見條帶出現(xiàn)，初步表明載體構(gòu)建成功，見圖1。

Figure1.The plasmid of pBTM116－MIF was identified by polyacrylamide gelelectrophoresis(PAGE).1:pBTM116 －MIF;2:pBTM116;M:DNA marker.圖1 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定所構(gòu)建的pBTM116－MIF質(zhì)粒

2 誘餌質(zhì)粒測序鑒定

將重組誘餌質(zhì)粒pBTM116－MIF擴(kuò)增純化后測序，測序結(jié)果在GenBank上與人MIF基因序列進(jìn)行BLAST比較分析，證明所構(gòu)建的亞克隆基因MIF序列正確，讀碼框架與pBTM116－LexA一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖2。

3 骨肉瘤pACT2－cDNA文庫中陽性克隆的篩選及鑒定

將pACT2－cDNA陽性克隆質(zhì)粒分離、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及測序，將所獲序列在GenBank上進(jìn)行BLAST比較分析，發(fā)現(xiàn)篩選出的基因是TXNL2。

Figure2.The sequence and the sequencing result of pBTM116－MIF plasmid.圖2 pBTM116－MIF序列與測序結(jié)果

4 TXNL2－MIF在酵母雙雜交上的相互作用

采用酵母雙雜交技術(shù)，利用人MIF催化TPOR活性域作為誘餌，從人骨肉瘤cDNA文庫百萬以上的基因中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)TXNL2可能是MIF的結(jié)合蛋白。重新分別構(gòu)建野生型的pBTM116－MIF和pACT2－TXNL2重組質(zhì)粒，將其共轉(zhuǎn)染L40酵母菌，檢測HIS3報告基因的活性及β－半乳糖苷酶反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)只有pBTM116－MIF和pACT2－TXNL2共轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)陽性結(jié)果，而其它對照組均呈陰性結(jié)果，見圖3。

Figure3.The interaction of TXNL2 and MIF was discovered by yeast two－h(huán)ybrid system.圖3 酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)TXNL2與MIF的相互作用

5 重組質(zhì)粒pcDNA3.1－Myc－TXNL2在 MCF7細(xì)胞中的表達(dá)

Western blotting實(shí)驗(yàn)中，用anti－Myc抗體檢測轉(zhuǎn)染的MCF7細(xì)胞，其蛋白提取物在分子量37 kD處有明顯的目的條帶，空載體轉(zhuǎn)染對照組未見目的條帶，GAPDH蛋白內(nèi)參照顯示各泳道蛋白量基本相等，見圖4。

Figure4.The expression of Myc－TXNL2 protein in MCF－7 cell line.圖4 Myc－TXNL2蛋白在MCF7細(xì)胞中的表達(dá)

6 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將pcDNA3.1－Myc－TXNL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 MCF－7細(xì)胞，檢測MCF－7細(xì)胞內(nèi)源性的MIF蛋白是否能與外源性轉(zhuǎn)染的Myc－TXNL2相互作用，結(jié)果表明，MIF抗體能夠共沉淀Myc－TXNL2，對照組則不能夠檢測出相應(yīng)蛋白，見圖5。

7 免疫熒光共定位結(jié)果

將pcDNA3.1－Myc－TXNL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF－7細(xì)胞、制備細(xì)胞爬片，免疫熒光觀察MIF和Myc－TXNL2蛋白在細(xì)胞中的分布情況，結(jié)果顯示Myc－TXNL2與MIF在細(xì)胞質(zhì)中分布位置相同，見圖6。

Figure5.Myc－TXNL2 and MIF proteins were co－immunoprecipitated by MIF antibody in MCF －7 cell line.圖5 Myc－TXNL2與MIF蛋白免疫共沉淀結(jié)果

Figure6.Co－localization of Myc－TXNL2 and MIF were analyzed by immunofluorescence.圖6 免疫熒光檢測Myc－TXNL2和MIF的共定位

討 論

大量研究表明，體內(nèi)MIF具有重要的互變異構(gòu)酶活性，其活性部位在MIF的N末端，但其生理學(xué)意義一直存在爭論。因?yàn)闆]有發(fā)現(xiàn)其生理學(xué)意義的底物，而且將互變異構(gòu)酶致死性突變，仍然產(chǎn)生MIF樣生物活性[3]。于是有人推測MIF的互變異構(gòu)酶活性在早期生物進(jìn)化過程中起作用，而在現(xiàn)有的精細(xì)的免疫防御系統(tǒng)中不再需要互變異構(gòu)酶活性。

TPOR涉及二硫化物介導(dǎo)的氧化－還原反應(yīng)，其催化活性是由位于CXXC區(qū)的2個半胱氨酸之間二硫鍵的形成或還原所決定。CXXC區(qū)鄰近的殘基和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)決定了TPOR的氧化還原電位。所有哺乳類生物的MIF都保留了完整的CALC基序。采用S－烷化實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析，證明在氧化條件下，重組的人MIF一段區(qū)域能夠形成二硫鍵結(jié)構(gòu)，該區(qū)域包括第57～60位之間的半胱氨酸殘基[5]，可見二硫鍵的形成出現(xiàn)在MIF的氧化條件下。然而，生物化學(xué)和交聯(lián)分析表明，在MIF分子內(nèi)二硫鍵的形成不涉及半胱氨酸殘基[6－7]。這種矛盾的現(xiàn)象，可能是由于體內(nèi)外MIF所處的氧化－還原狀態(tài)不同。目前并不清楚在生理條件下，細(xì)胞內(nèi)MIF的CXXC巰基還原－再還原時的酶促反應(yīng)是如何進(jìn)行的。

MIF表現(xiàn)出TPOR活性，主要類似于二硫化物還原酶，還原蛋白質(zhì)和肽類的二硫鍵。Potolicchio等[8]鑒定了MIF的巰基蛋白質(zhì)氧化還原酶活性，證明MIF能催化還原胰島素。在胰島素還原反應(yīng)中，其協(xié)同底物是谷胱甘肽和二硫辛酰胺。MIF也能還原小分子二硫化物，如2－羥乙基二硫化物(2－h(huán)ydroxyethyl disulfide，2－HED)。MIF的 TPOR 活性完全依賴于半胱氨酸Cys60的存在，而半胱氨酸Cys57的突變(Cys－Ser)，僅影響其部分催化活性。MIF半胱氨酸Cys81與其氧化還原酶活性無關(guān)[9]。

在體內(nèi)，已經(jīng)證實(shí)MIF的產(chǎn)生受控于細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。另一方面，MIF似乎直接參與了細(xì)胞對氧化還原應(yīng)激的調(diào)控。H2O2對上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和新生兒心肌細(xì)胞的刺激，能促使 MIF的分泌[10]。H2O2作用于細(xì)胞，可能使細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽減少，從而改變了細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG(氧化型谷胱甘肽)比例。應(yīng)用可誘導(dǎo)的Tet－off細(xì)胞系統(tǒng)，證明HeLa細(xì)胞受到氧化刺激時，細(xì)胞內(nèi)MIF水平增加，使細(xì)胞內(nèi)GSH濃度顯著增加，引起細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力的提高[11]。MIF對細(xì)胞的氧化－還原應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)顯得很復(fù)雜。MIF與胰島素、肝細(xì)胞生長因子的相互作用，均涉及攜帶二硫鍵的蛋白質(zhì)的氧化－還原反應(yīng)。MIF對胰島素的氧化－還原作用的證據(jù)主要來自于體外實(shí)驗(yàn)。

MIF介導(dǎo)的氧化還原作用關(guān)系到免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，盡管對MIF蛋白質(zhì)序列、三維構(gòu)象及功能做了大量的比較性研究，仍有許多問題待解決。如MIF酶的底物、受體是什么?為什么MIF功能在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果往往矛盾?MIF與細(xì)胞內(nèi)氧化還原調(diào)控的密切相關(guān)，但它們之間的直接作用證據(jù)卻一直未被發(fā)現(xiàn)[12－13]。在本研究中，我們首先構(gòu)建了含人MIF蛋白第57～60位之間Cys－Ala－Leu－Cys活性區(qū)域的誘餌質(zhì)粒 pBTM116－MIF，并采用順序轉(zhuǎn)染法，從骨髓瘤基因文庫中篩選出數(shù)個可能與MIF催化TPOR活性區(qū)域相結(jié)合的基因片段。將這些質(zhì)粒分別與誘餌質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)染L40酵母菌，以這些質(zhì)粒與pBTM116空載體共轉(zhuǎn)染作為對照，確認(rèn)這幾個基因片段所表達(dá)的蛋白是與MIF催化TPOR活性域相合，而不是與pBTM116載體相結(jié)合。通過基因測序﹑氨基酸讀碼框架檢測及BLAST分析，確認(rèn)了這幾個基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過β－半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)鑒定，證實(shí)其中TXNL2蛋白在酵母水平上確能與MIF催化TPOR活性區(qū)域相結(jié)合。檢索分析該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能，提示它屬硫氧還蛋白家族成員，具有氧化還原活性，還具有CXXC基序，與MIF氧化還原功能相關(guān)性極大。查閱文獻(xiàn)，類似的報道有力支持我們的發(fā)現(xiàn)[12－13]。我們進(jìn)而采用mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)，獲得可表達(dá)TXNL2蛋白活性片段的cDNA，并相應(yīng)構(gòu)建了融合蛋白pcDNA3.1－Myc－TXNL2。將pcDNA3.1－Myc－TXNL2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF－7細(xì)胞，檢測MCF－7細(xì)胞內(nèi)源性的MIF蛋白是否能與外源性轉(zhuǎn)染的Myc－TXNL2相互作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MIF抗體能夠免疫沉淀Myc－TXNL2和MIF蛋白。結(jié)合已有的報道和本研究結(jié)果，我們推測TXNL2可能與MIF的氧化還原作用相關(guān):MIF蛋白質(zhì)的構(gòu)型改變，影響了它與TXNL2的結(jié)合;而TXNL2 CXXC基序中二硫鍵的變化，影響了MIF氧化還原能力。

與其它細(xì)胞因子相比，MIF在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中具有獨(dú)特的作用，目前在治療動脈粥樣硬化斑塊時往往首選MIF作為治療靶點(diǎn)[14]。在炎癥、氧化應(yīng)激、免疫介導(dǎo)的各種疾病的診斷及療效評價中，MIF也是非常重要的指標(biāo)[15]。因此，MIF催化TPOR活性區(qū)域氧化還原機(jī)制的研究，對闡明臨床病理生理變化過程有著重要的實(shí)際意義。

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