張 喆，朱 寧，劉 莉，孫賀英，張永強(qiáng)，劉蘭瑞，馮建軍

(1河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000;2保定市第一中心醫(yī)院;3河北大學(xué)附屬醫(yī)院;4保定市疾病預(yù)防控制中心;5保定市第五醫(yī)院;6臨城縣人民醫(yī)院)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是臨床上的常見病、多發(fā)病。與非DM人群相比，DM患者各種心臟疾病如心絞痛、心律失常、心力衰竭等的發(fā)生率明顯增加，且這些并發(fā)癥也往往是導(dǎo)致患者最終死亡的重要原因。因此，保護(hù)DM患者心肌、延緩心肌損傷、防止各種并發(fā)癥發(fā)生對(duì)于提高生存質(zhì)量、延長(zhǎng)壽命顯得尤為重要。牛磺酸(Taurine)作為人體內(nèi)條件必需氨基酸，是可興奮組織(神經(jīng)、肌肉)細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的自由氨基酸。近年來?；撬崤cDM之間的關(guān)系受到高度重視。實(shí)驗(yàn)研究與臨床資料表明，補(bǔ)充?；撬釋?duì)DM神經(jīng)病變、胰島素抵抗及心血管并發(fā)癥具有顯著防治作用［1，2］。2011年9月，我們觀察了?；撬釋?duì)實(shí)驗(yàn)性DM大鼠模型氧化應(yīng)激損傷及心肌細(xì)胞凋亡的影響，旨在進(jìn)一步探討?；撬釋?duì)DM大鼠心臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周;?；撬?上海伯奧生物技術(shù)公司)，鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司);葡萄糖試劑盒(中生北空生物科技股份有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)及大鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL試劑盒，Roche公司)等。

1.2 動(dòng)物分組與處理 將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CN組)、DM組、?；撬峤M(TAU組)各10只。其中后兩組均一次性尾靜脈注射2%的STZ(以pH值4.3的0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖溶液配制)45 mg/kg，繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，1周后經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血、以葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖，＞16.7 mmol/L者確定為DM制模成功［3］;其后TAU組以牛磺酸(30 g/L)生理鹽水溶液300 mg/(kg·d)灌胃，CN組、DM組予等體積生理鹽水灌胃，均連續(xù)8周。

1.3 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，三組均用25%烏拉坦4 mL/kg麻醉，腹主動(dòng)脈取5 mL血液，離心取上清，采用722型可見光分光光度計(jì)檢測(cè)MDA、SOD、NO水平，嚴(yán)格參照試劑盒說明書操作。

1.4 心肌組織iNOS活性及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(Apoptotic index，AI)檢測(cè) 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，三組均取下心臟，一部分心肌組織勻漿后參照試劑盒說明測(cè)定iNOS活性。另一部分心肌組織置于15%甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片機(jī)常規(guī)切片，厚度約5 μm，切片后嚴(yán)格按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色，在普通光學(xué)顯微鏡下即可準(zhǔn)確定位，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，分別記數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，以凋亡心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)的百分比作為 AI［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齊時(shí)多組間比較使用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 血清MDA、SOD、NO水平 與CN組比較，DM組血清MDA水平明顯增加(P＜0.01)，SOD活性顯著降低(P＜0.01)，NO水平升高(P＜0.05);與 DM組比較，TAU組血清 MDA水平降低(P＜0.05)，SOD活性提高(P＜0.05)，NO水平降低(P＜0.05)，見表1。

表1 三組血清MDA、SOD、NO水平比較(n=10，±s)

表1 三組血清MDA、SOD、NO水平比較(n=10，±s)

注:與 CN 組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與 DM 組比較，#P ＜0.05

組別 MDA(nmol/L) SOD(U/mL) NO(mmol/L)DM 組 8.31 ±1.75△ 0.65 ±0.22△ 109.53 ±20.41*TAU 組 4.09 ±1.18# 2.28 ±1.21# 74.87 ±19.72#CN組1.92 ±0.66 2.86 ±1.37 66.02 ±17.33

2.2 心肌組織iNOS活性與心肌細(xì)胞凋亡情況與CN組比較，DM組心肌組織iNOS活性明顯增高(P＜0.05)，心肌細(xì)胞 AI升高(P＜0.01);與 DM 組比較，TAU組心肌組織iNOS活性降低(P＜0.05)，且心肌細(xì)胞 AI降低(P＜0.01)，見表2。

表2 三組心肌組織iNOS、AI比較(n=10，±s)

表2 三組心肌組織iNOS、AI比較(n=10，±s)

注:與 CN 組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01;與 DM 組比較，#P ＜0.05，○P ＜0.01

組別 iNOS(μkat/g) AI(%)DM 組 31.61 ±6.29* 33.52 ±5.74△TAU 組 20.89 ±4.48# 15.49 ±3.53○CN組16.12 ±3.83 4.08 ±1.17

3 討論

心血管疾病是DM患者最常見的并發(fā)癥與死亡原因。長(zhǎng)期高血糖不僅可引起血管損傷，同時(shí)也可直接損害心肌細(xì)胞。已有研究證實(shí)，高血糖能夠觸發(fā)活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)引起氧化蛋白的修飾，增加氧化應(yīng)激［5］;心肌是受ROS影響的主要器官之一，因此氧化應(yīng)激在DM心肌損傷中起關(guān)鍵作用。體內(nèi)的NO是一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)蛋白家族催化生成的具有雙向調(diào)節(jié)功能的氣態(tài)分子，參與多種生理與病理過程，如低濃度NO可增加心肌收縮力;而高濃度NO可產(chǎn)生負(fù)性變時(shí)效應(yīng)，減弱心肌收縮力，增加NO來源的活性氮族(Reactive nitrogen species，RNS)如過氧化亞硝酸鹽的形成，產(chǎn)生廣泛細(xì)胞毒作用，參與組織損傷和疾病的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)，NOS具有三種異構(gòu)酶即神經(jīng)型一氧化氮合酶(Neuronal NOS，nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial NOS，eNOS)和iNOS，其中eNOS和nNOS在哺乳動(dòng)物的心肌持續(xù)表達(dá);iNOS在正常生理狀態(tài)下低表達(dá)或表達(dá)缺陷，僅出現(xiàn)在收縮功能受損時(shí)損傷的心肌細(xì)胞［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與CN組比較，DM組血清MDA水平顯著增高、SOD活性明顯下降、NO水平升高，心肌組織iNOS活性明顯增高;與DM組比較，TAU組血清MDA水平降低、SOD活性提高、NO水平降低，心肌組織iNOS活性明顯降低。表明DM大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)明顯，氧自由基清除功能下降;DM還可引起iNOS活性增高，促進(jìn)產(chǎn)生高濃度NO，后者可增加氧化應(yīng)激形成氧自由基進(jìn)一步損傷心肌;?；撬崮軌蚪档蚷NOS活性、增強(qiáng)SOD活性、減少M(fèi)DA生成和降低NO濃度。證實(shí)?；撬峋哂忻黠@抗氧化、保護(hù)心肌的作用。

細(xì)胞凋亡是指在一定生理或病理?xiàng)l件下，受基因調(diào)控的自身程序性細(xì)胞死亡。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡失調(diào)參與許多重大疾病的發(fā)病，腫瘤發(fā)生、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成等均與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系［7］。同樣，細(xì)胞凋亡也是DM心肌破壞的一個(gè)重要形式，無論凋亡還是壞死均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量降低，最終損傷心功能，引起心血管系統(tǒng)并發(fā)癥［8］。本實(shí)驗(yàn)顯示，與CN組比較，DM組心肌細(xì)胞AI顯著升高;與DM組比較，TAU組心肌細(xì)胞AI明顯降低。初步證實(shí)?；撬峥梢詼p少DM性心肌細(xì)胞凋亡。此可能繼發(fā)于其抗氧化功能(體內(nèi)氧自由基過多可啟動(dòng)細(xì)胞凋亡)，即?；撬峥赡芡ㄟ^降低iNOS活性、增強(qiáng)SOD活性減少氧自由基產(chǎn)生，進(jìn)而抑制凋亡發(fā)生。但具體的機(jī)制如凋亡相關(guān)基因 Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因c-myc、抑癌基因p53等的表達(dá)變化以及更深層次的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，?；撬釋?duì)實(shí)驗(yàn)性DM大鼠心臟具有保護(hù)作用，可能機(jī)制為減輕氧化應(yīng)激損傷、減少心肌細(xì)胞凋亡。

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