(北京軍區(qū)總醫(yī)院，北京 107000)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡率第2位。我國年均新發(fā)宮頸癌約13.15萬例，占全球總新發(fā)病例的28.8%，位居女性惡性腫瘤第1位［1］。近年來研究顯示腫瘤干細(xì)胞是腫瘤形成的重要原因［2］，其具有干細(xì)胞特性，在腫瘤細(xì)胞中所占數(shù)量少，但可以進(jìn)行自我更新和多項(xiàng)分化，從而使腫瘤不斷生長［3］。研究發(fā)現(xiàn)在白血病、乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、胰腺癌、肺癌等許多腫瘤中都存在有腫瘤干細(xì)胞［4～7］。近年研究表明，干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sox-2基因是性別決定區(qū)因子，在胚胎干細(xì)胞維持自我更新及多向性發(fā)展過程中起著決定性的作用，是維持膠質(zhì)瘤祖細(xì)胞增殖和遺傳特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其異常表達(dá)與肺癌、乳腺癌、口腔腫瘤、食管癌、睪丸干細(xì)胞腫瘤、腦膜瘤等許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［8］。目前宮頸癌干細(xì)胞的研究尚處于初步階段，關(guān)于Sox-2基因在宮頸癌中表達(dá)的研究尚少見。2009年2月～2011年9月，本研究觀察了Sox-2蛋白及其mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)變化，為宮頸癌的診斷和治療從干細(xì)胞角度提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 宮頸癌組織標(biāo)本84例，宮頸CIN組織標(biāo)本66例，正常宮頸組織標(biāo)本22例。宮頸癌及宮頸CIN組織分別來源于在北京軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科行手術(shù)切除治療、經(jīng)病理證實(shí)的宮頸癌及宮頸CIN患者。其中宮頸癌患者年齡33～56歲，宮頸CIN患者年齡28～40歲。正常宮頸組織來源于行子宮肌瘤全切術(shù)的患者，患者年齡40～51歲。三組患者年齡相比，P均＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人Sox-2單克隆抗體購自美國Epitomics公司，鏈霉卵白素—生物素過氧化物酶(SP)標(biāo)記的試劑盒及DAB均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Trizol Reagent試劑盒(美國Invitrogen公司)，2×Taq PCR Master Mix(北京天根生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2 Sox-2蛋白的檢測 采用免疫組化SP法。標(biāo)本行4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，用3%的H2O2抑制內(nèi)源性過氧化酶活性，0.01 mol/L枸櫞酸鈉(pH 6.0)行抗原修復(fù)，在約100℃條件下加熱10 min，PBS洗片，10%BSA封閉非特異性位點(diǎn)10 min，一抗4℃孵育過夜，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。PBS沖洗3遍，SP法染色，DAB顯色后行蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。

1.2.3 Sox-2 mRNA的檢測 采用RT-PCR法。按照Trizol Reagent試劑盒說明書提取組織總RNA。按照2×Taq PCR Master Mix使用說明，在20 μL的反應(yīng)體系中合成細(xì)胞總cDNA。PCR體系為50 μL，內(nèi)含模板 2 μL，Taq 酶 12.5 μL，目的引物各 0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。反應(yīng)條件除退火溫度外均為預(yù)變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火58 s，延伸72℃ 30 s，共25個(gè)循環(huán)。Sox-2上游引物:5'-CCCTGTGGTTACCTCTTCC-3'， 下 游 引 物:5'-CTCCCATTTCCCTCGTTT-3'，退火溫度58℃，產(chǎn)物長度為295 bp;內(nèi)參GAPDH上游引物:5'-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3'，下游引物:5'-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3'，退火溫度58℃，產(chǎn)物長度為616 bp。

1.2.4 結(jié)果判定 ①Sox-2蛋白:光鏡下 Sox-2蛋白主要定位于細(xì)胞核，部分胞質(zhì)著色。免疫組化結(jié)果采用半定量計(jì)分法判定.按著色程度評(píng)分，不著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分;按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，無陽性細(xì)胞記0分，陽性細(xì)胞百分比＜25%計(jì)1分，25% ～50%計(jì)2分，51% ～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)為4分。上述兩項(xiàng)評(píng)分乘積＜2分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，＞6分為強(qiáng)陽性(+++)，+～+++判定為Sox-2蛋白表達(dá)陽性。②Sox-2 mRNA:用內(nèi)參照GAPDH光密度值標(biāo)化目的基因的光密度值進(jìn)行半定量分析，得到Sox-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量:(Sox-2 mRNA光密度值/GAPDH光密度值)×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2蛋白的表達(dá)比較 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2蛋白陽性表達(dá)率分別為85.71%(72/84)、36.36%(24/66)、0.18%(4/22)，三者相比，P均 ＜0.01。

2.2 Sox-2蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

見表1。由表1可見，宮頸癌組織中Sox-2蛋白表達(dá)水平與患者年齡無關(guān)(P＞0.05);與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、分化程度有關(guān) (P均＜0.05)。

2.3 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2 mRNA的表達(dá)比較 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.877 ±0.208、0.463 ±0.093、0.243 ±0.023，Sox-2 mRNA在宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中的表達(dá)有顯著性差異(P均＜0.01)，Sox-2 mRNA的表達(dá)隨著宮頸癌病理學(xué)分級(jí)的上升而升高。詳見圖1。

3 討論

研究認(rèn)為，宮頸癌中也存在腫瘤干細(xì)胞，對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有重要作用［9］。腫瘤干細(xì)胞來源于宮頸儲(chǔ)備細(xì)胞的一部分［10］，因此有關(guān)學(xué)者已將研究目標(biāo)指向?qū)m頸儲(chǔ)備細(xì)胞，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的重要因素，研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞球來源于HPV感染的宮頸干細(xì)胞［11］，這類細(xì)胞可能具有自我更新和多項(xiàng)分化潛能，其常見標(biāo)記物有 CK17、p63 和 p16［12］。馮定慶等［13］從19例子宮頸癌患者的腫瘤組織中分離獲得宮頸癌干細(xì)胞，并分離培養(yǎng)形成腫瘤細(xì)胞球，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4和Piwil2蛋白，接種于裸鼠皮下12周后全部成瘤，其病理類型與來源標(biāo)本一致。

表1 Sox-2蛋白表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

圖1 宮頸癌組織、CIN組織及正常宮頸組織中Sox-2 mRNA的表達(dá)比較

Sox-2基因被認(rèn)為在腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育方面起重要作用。Sox是一類具HMGDNA結(jié)合區(qū)域特征性的轉(zhuǎn)錄因子家族［14］，在真核生物中高度保守的，其蛋白是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在性別決定和分化、早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及多種組織器官的形成中具有重要作用。其中Sox-2亞型歸屬于該家族B群，參與誘導(dǎo)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過程。研究發(fā)現(xiàn)，Sox-2是誘導(dǎo)干細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其與KLF4、Oct4和c-Myc共同作用，可以誘導(dǎo)鼠和人成體細(xì)胞成多功能祖細(xì)胞(IPS)，表明其具有干細(xì)胞調(diào)控的特性。在Oct 4、Sox-2、NANOG和 LIN28聯(lián)合誘導(dǎo)時(shí)，也能使人成體細(xì)胞發(fā)生上述變化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞還有胚胎干細(xì)胞特性。表明Sox-2具有干細(xì)胞多向分化調(diào)控的特性，提示Sox-2基因是維持干細(xì)胞特性的重要基因。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Sox-2在肺癌［15］、食管癌和肛管鱗癌中的表達(dá)率分別為94%、96%和100%，在相應(yīng)的腺癌中表達(dá)率21%、13%和17%，提出Sox-2有可能作為消化道腫瘤或其他腫瘤鱗癌和腺癌的分子區(qū)分標(biāo)志性指標(biāo)［13］。最新基因干涉研究表明，對(duì)Sox-2基因表達(dá)進(jìn)行干涉可阻止乳腺癌細(xì)胞進(jìn)入S期，使其細(xì)胞周期停留在G1期，并改變了細(xì)胞形態(tài)［16］。說明干預(yù)Sox-2基因表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

本研究在Ⅰ期及Ⅱa期宮頸癌患者中均檢測到Sox-2蛋白表達(dá)，說明宮頸癌組織中可能均存在數(shù)量不等、具有干細(xì)胞特征的多能性低分化或未分化的腫瘤細(xì)胞。這些表達(dá)Sox-2的具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞可能就是宮頸癌干細(xì)胞，有希望在細(xì)胞分離純化和體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步分離和鑒定。本研究結(jié)果顯示，Sox-2蛋白陽性表達(dá)率及其mRNA相對(duì)表達(dá)量宮頸癌組織＞CIN組織＞正常宮頸組織，且Sox-2蛋白的表達(dá)隨宮頸癌分化程度的降低而增加。腫瘤細(xì)胞分化程度越低，其基因結(jié)構(gòu)及表型越接近原始幼稚的干細(xì)胞，惡性程度相對(duì)較高的宮頸癌組織中存在具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞數(shù)量也較多。上述結(jié)果提示Sox-2可能參與了宮頸癌組織的癌變過程，并可能與宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，且其高表達(dá)的腫瘤其惡性程度高，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果一致［13～15］。

綜上所述，Sox-2與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，研究Sox-2蛋白及基因在宮頸癌中的作用及其機(jī)制有助于進(jìn)一步了解宮頸癌的生物學(xué)行為，有望為該病的早期診斷和治療提供新的分子靶點(diǎn)。

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