黃 艷，聶 偲，田玲玲，胡冬華，彭雪梅，王小平，李雅蘭

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510630)

原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)通過掃描探針與樣品表面間的微小作用力而得到樣品的表面形貌信息。該技術(shù)從三維的角度描述樣品表面的微觀結(jié)構(gòu)及相關(guān)信息，不受樣品是否有導(dǎo)電性的限制，且樣品制備簡單，具有亞納米級的超高分辨率，因此已被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)等領(lǐng)域［1］。

術(shù)中失血回收(intraoperative blood savlage，IOBS)是指將外傷和手術(shù)中流出的大量血液收集后經(jīng)過濾、離心、洗滌，收集濃縮后的紅細(xì)胞給病人回輸。一般60%～70%的失血可以通過此方法回收。此方法對減少異體輸血相關(guān)的感染性和非感染性并發(fā)癥，保護血資源起到積極的作用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床［2］。與此同時，洗滌過程對紅細(xì)胞的影響也日益引起人們的關(guān)注。本文旨在應(yīng)用原子力顯微鏡觀察脊柱手術(shù)中經(jīng)自體血液回收處理后紅細(xì)胞的外貌，為臨床應(yīng)用回收式自體輸血的安全性和可行性提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 病例選擇

選取2011年5～7月暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院擇期行脊柱手術(shù)的患者10例，男5例，女5例，年齡35～65歲。美國麻醉醫(yī)師協(xié)會(American Society of Anesthesiology，ASA)體格情況分級I～Ⅲ級，既往均無惡性腫瘤及無血液系統(tǒng)疾病，無高血脂及血電解質(zhì)異常。既往有高血壓病史者均已在術(shù)前予以控制，其它常規(guī)化驗檢查均正常。

2 麻醉方法

麻醉前30 min肌注阿托品0.5 mg和苯巴比妥100 mg。所有患者均采用靜脈全麻。異丙酚和瑞芬太尼維持麻醉，阿曲庫銨間斷靜脈注射維持肌肉松弛。術(shù)中輸注復(fù)方乳酸鈉林格氏液和6%羥乙基淀粉維持血容量及循環(huán)穩(wěn)定。

3 自體血回收操作

手術(shù)常規(guī)操作并安裝好血液回收機(自體－30COP型，北京京精醫(yī)療設(shè)備公司)，一次性使用血液回收套件(FCR－2000F型，寧波菲拉爾醫(yī)療用品有限公司)，術(shù)前以肝素鹽水(肝素鈉25000 U加入生理鹽500 mL)預(yù)沖雙腔管道及回收罐，患者的術(shù)野活動性出血由連接中心負(fù)壓吸引(－150～－200 mmHg)至血液回收罐，回收血液與抗凝劑的容積比為10∶1，回收血液經(jīng)離心(5000 r/min)、清洗(生理鹽水與回收血液容積比為3∶1)，通過半透膜過濾，去除清洗液、細(xì)胞碎片、脂肪滴、異物、游離血紅蛋白、血漿及抗凝劑，濃縮后紅細(xì)胞壓積為30% ～40%，回輸給患者。血液回輸量200～700 mL。

4 取材

收集所有患者手術(shù)開始前外周靜脈血2 mL(T1)，洗滌前血液2 mL(T2)，洗滌后血液2 mL(T3，洗滌后指清洗完畢，紅細(xì)胞懸液自動泵入輸血袋內(nèi)儲存)，回輸洗滌血1 h后外周靜脈血2 mL(T4)。以上所有標(biāo)本均以肝素鈉(1×10 U/L)抗凝，置于15 mL離心管中，4℃冰箱保存。

5 紅細(xì)胞樣本的制備

將血樣從冰箱中拿出，在室溫恢復(fù)約1 h，離心(3500 r/min)10 min，棄上層血漿及白細(xì)胞層，緩慢輕輕沿離心管壁將紅細(xì)胞置于離心管內(nèi)10倍體積量的等滲pH 7.40的PBS緩沖液，每次離心(2000 r/min)5 min，除去上清液及沉淀表層白色絨毛，重復(fù)洗滌3次。最后將紅細(xì)胞再懸浮于PBS中制成細(xì)胞壓積為1%的細(xì)胞，取20 μL此懸液滴于干凈的蓋玻片上，1%的戊二醛固定15 min，之后蒸餾水沖洗去除固定液7次，防止形成鹽結(jié)晶，多余的水分用濾紙吸干，室溫下自然風(fēng)干。

6 熒光正置顯微鏡觀察紅細(xì)胞

取4個時點的紅細(xì)胞，在400倍放大率下瀏覽整個玻片，隨機選取1000個細(xì)胞疏密程度適中，計數(shù)紅細(xì)胞總數(shù)及異常細(xì)胞數(shù)，計算紅細(xì)胞畸形率，即球形、橢圓形、梨形、花瓣形紅細(xì)胞以及破碎紅細(xì)胞的百分比，取均數(shù)作比較。

7 AFM觀察紅細(xì)胞

樣品干燥后置于NanoScopeV AFM(Veeco instruments)載物臺上，利用Olympus倒置顯微鏡觀察血細(xì)胞的分散情況，選擇分散均勻的區(qū)域在空氣中應(yīng)用AFM進行掃描成像。控制濕度為50% ～60%，Nanoscope 8.10 Catalyst模式，Tap150AI－G 硅探針(Resonant Freq 150 kHz，F(xiàn)orce Constant 5 N/m)。每種樣本掃描20個細(xì)胞5個區(qū)域;每個區(qū)域掃描范圍為30 μm～1 μm，掃描順序依次為30 μm、整個紅細(xì)胞、紅細(xì)胞膜表面周邊掃描1 μm大小的區(qū)域，掃描速率為0.15～0.7 Hz。平滑處理掃描之后的圖像，以消除慢掃描方向的噪音。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用One－way ANOVA分析方法，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

熒光正置顯微鏡下多個紅細(xì)胞的形貌如圖1所示。術(shù)前靜脈血、洗滌前血液、洗滌后血液和回輸后靜脈血的紅細(xì)胞畸形率分別為(2.2±1.8)%、(9.1±0.9)%、(7.4±1.5)%和(6.8±1.4)%。T1時點的紅細(xì)胞畸形率低于T2、T3、T4(n=10，P＜0.05)，而后三者紅細(xì)胞畸形率并無顯著差異。

AFM下單個紅細(xì)胞的形貌結(jié)果見圖2～5。圖2顯示術(shù)前的紅細(xì)胞形態(tài)完整，輪廓清晰，弧度流暢，富有光澤，中間凹陷明顯;表面積與體積的比值較大，有利于細(xì)胞變形、氣體交換和攜帶;膜比較柔軟，容易發(fā)生變形;經(jīng)測量，直徑為8.946 μm，厚度為1.601 μm。圖3顯示洗滌前紅細(xì)胞雖然仍為雙凹圓盤狀，但呈腫脹狀態(tài);中間凹陷處不明顯，無規(guī)則，存在重疊及褶皺;經(jīng)測量，直徑為7.918 μm，表面最高高度為2.053 μm。圖4顯示洗滌后紅細(xì)胞雖然仍為雙凹圓盤狀，中間凹陷處明顯，但膜表面有不規(guī)則突起及破損;經(jīng)測量，直徑為7.932 μm，表面最高高度為1.591 μm。圖5顯示回輸后紅細(xì)胞基本為雙凹圓盤狀，膜表面比較光滑;經(jīng)測量，直徑為7.962 μm，表面最高高度為 1.701 μm。

Figure 1.Different red blood cells viewed with fluorescent microscope(×400).A:blood before operation;B:unprocessed blood in cell saver;C:processed blood in cell saver;D:blood 1 h after IOBS.圖1 熒光正置顯微鏡下4個時點的紅細(xì)胞形貌圖

Figure 2.AFM topography and height profile of red blood cell before operation.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.圖2 術(shù)前紅細(xì)胞的AFM的形貌圖及細(xì)胞高度曲線圖

Figure 3.AFM topography and height profile of unprocessed red blood cell in cell saver.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.圖3 洗滌前紅細(xì)胞AFM的形貌圖及細(xì)胞高度曲線圖

Figure 4.AFM topography and height profile of processed red blood cell in cell saver.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.圖4 洗滌后紅細(xì)胞AFM的形貌圖及細(xì)胞高度曲線圖

Figure 5.AFM topography and height profile of red blood cell 1 h after IOBS.A:AFM topography of the cell;B:3D image of figure A;C:the height profile of the corresponding line in figure A.圖5 回輸后1 h紅細(xì)胞AFM的形貌圖及細(xì)胞高度曲線圖

以上結(jié)果表明，紅細(xì)胞經(jīng)過術(shù)野負(fù)壓吸引、過濾、離心、洗滌、收集、濃縮后，引起細(xì)胞膜的改變，雖然紅細(xì)胞在外貌上仍保持雙凹的特征，其膜表面無明顯破裂，但是出現(xiàn)了腫脹現(xiàn)象，即在表面積不明顯變化的情況下，細(xì)胞的體積變大，表面積與體積的比變小。部分細(xì)胞局部凸起，形態(tài)不規(guī)則，非雙凹圓盤狀，更有甚者細(xì)胞完全變形，破裂，可見細(xì)胞碎屑?；剌敽笱杭t細(xì)胞外貌基本上與術(shù)前一致。

AFM下紅細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)(周邊1 μm×1 μm的區(qū)域)見圖6。術(shù)前血紅細(xì)胞膜表面顆粒分布密集、連續(xù)，呈麥穗狀結(jié)構(gòu)，沒有明顯縫隙，膜表面基本沒有孔洞，膜結(jié)構(gòu)致密。回收血紅細(xì)胞膜表面顆粒分布紊亂，堆積型條索狀隆起與凹陷，呈不典型的多聚體與單體雜亂分布的顆粒及孔洞形貌，個別孔洞較深，較寬。回輸后血紅細(xì)胞基本與術(shù)前一致。與靜脈血相比，回收血表面平均粗糙度均增大，見表1。

Figure 6.AFM morphological images of blood(1 μm ×1 μm).A:blood before operation;B:unprocessed blood in cell saver;C:processed blood in cell saver;D:blood 1 h after IOBS.圖6 4個時點的紅細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)(周邊1 μm×1 μm 的區(qū)域)

表1 不同時點的紅細(xì)胞膜表面Ra和Rq的比較Table 1.Comparison of Ra and Rq of erythrocytes(nm..n=10)

表1 不同時點的紅細(xì)胞膜表面Ra和Rq的比較Table 1.Comparison of Ra and Rq of erythrocytes(nm..n=10)

Ra:profile arithmetic average error;Rq:root mean square roughness.*P ＜0.05 vs other groups.

Group Ra Rq Blood before operation 4.05 ±0.53 5.07 ±0.65 Unprocessed blood 16.40 ±5.04* 20.24 ±5.89*Processed blood 4.51 ±0.81 5.73 ±1.69 Blood 1 h after IOBS 4.38 ±2.58 2.53 ±3.19

討 論

近10年來，原子力顯微技術(shù)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，主要原因是具有其它技術(shù)所沒有的優(yōu)勢，如:樣品制備簡單，甚至不需要處理細(xì)胞樣品，對柔軟的細(xì)胞樣品的破壞微小，可對液體或近生理狀態(tài)下的細(xì)胞樣品進行觀察，使被測樣品保持其生物活性等等。而高分辨率(1 nm，電子顯微鏡10 nm)的特點使其更好地被應(yīng)用于研究單個生物大分子和細(xì)胞膜表面微觀結(jié)構(gòu)。許多光鏡和電鏡所不能及的細(xì)小結(jié)構(gòu)，如單個細(xì)胞表面突起或顆粒大小在AFM中可以一目了然。

自體血回輸在臨床上使用的范圍也不斷擴大。Catling等［3］對腫瘤病人進行血液回輸研究發(fā)現(xiàn)，回輸血液經(jīng)過白細(xì)胞過濾器后沒有找到腫瘤細(xì)胞，僅僅發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞碎片，而這些碎片并不能導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。最新研究也表明，自體血回輸沒有增加腸內(nèi)容物污染及全身敗血癥患者術(shù)后的感染，所以感染患者并不應(yīng)視為自體血回輸?shù)慕^對禁忌證［4－5］。因此，國外很多臨床醫(yī)生認(rèn)為使用IOBS唯一的禁忌癥就是患者拒絕［6］。雖然IOBS在臨床上有如此廣泛的應(yīng)用，但關(guān)于洗滌后紅細(xì)胞質(zhì)量方面的研究結(jié)果不一致。因此本研究通過AFM觀察回收處理前后紅細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化，了解血液回收對紅細(xì)胞形態(tài)及功能的影響。

紅細(xì)胞是血液中數(shù)量最多的血細(xì)胞，正常的成熟紅細(xì)胞無核，呈雙凹圓盤狀，直徑為7～9 μm。而這個特殊的形狀是影響紅細(xì)胞變形能力、懸浮穩(wěn)定性和滲透脆性的重要因素，因為紅細(xì)胞中心到大部分表面的距離都很短，具有較大的氣體交換面積，故有利于紅細(xì)胞內(nèi)外O2和CO2的交換。紅細(xì)胞維持這種正常形態(tài)，可使其表面積(S)與體積(V)之比較大，有利于紅細(xì)胞經(jīng)歷各種變形而不增加其表面積。正常紅細(xì)胞的S/V高于1.5，如果S/V等于1.0則呈球形，S/V等于0.7則呈橢圓球形，后兩者均使紅細(xì)胞變形性下降［7］。

正常形態(tài)的紅細(xì)胞具有良好的變形能力和抗剪切應(yīng)力，其重要生理意義在于能適應(yīng)大血管中快速血流的高剪切力作用，降低血液黏度;使直徑為7～8 μm的紅細(xì)胞通過直徑僅有3 μm的毛細(xì)血管，為組織提供氧;促進氧在毛細(xì)血管水平的釋放和被攝?。?］。經(jīng)過血液回收機洗滌過后的紅細(xì)胞呈腫脹狀態(tài)，S/V變小，通過降低紅細(xì)胞的變形性，進而影響氧轉(zhuǎn)運和微循環(huán)灌注。

有研究表明手術(shù)創(chuàng)面的組織表面及空氣與手術(shù)野的紅細(xì)胞相接觸會對紅細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，而術(shù)中負(fù)壓吸引收集可以通過應(yīng)力損傷，造成紅細(xì)胞的變形和破壞，使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，如紅細(xì)胞變形能力消失，甚至嚴(yán)重變形或破碎造成溶血，導(dǎo)致血液回輸量減少。減少溶血的一種方式就是降低負(fù)壓吸引的壓力。Yazer等［9］證明了使用一種隨著吸引頭吸收空氣的壓力變化而自動調(diào)節(jié)負(fù)壓吸引壓力的裝置可以減少溶血。Waters等［10］研究所示，降低負(fù)壓吸引的壓力可以減少用生理鹽水稀釋的血液60%的溶血。在離心杯內(nèi)以5000 r/min速度高速離心旋轉(zhuǎn)的回收紅細(xì)胞會在外部應(yīng)力的方向上拉長，過大的外部應(yīng)力也可引起膜破壞而溶血，所以在負(fù)壓吸引與高速離心的作用下衰老紅細(xì)胞及細(xì)胞膜骨架結(jié)構(gòu)有缺陷，形態(tài)及變形能力較差的紅細(xì)胞容易發(fā)生破裂溶血而被清除。Cheng等［11］也認(rèn)為回收后的紅細(xì)胞更多的是年輕的正常紅細(xì)胞。本研究結(jié)果紅細(xì)胞畸形率小于本機構(gòu)前期的研究結(jié)果［12］，可能原因是在制樣過程中將紅細(xì)胞用PBS反復(fù)清洗3次，將細(xì)胞碎片及變形較大的紅細(xì)胞已經(jīng)清除大部分，故畸形率較低。回輸洗滌血1 h后，此時紅細(xì)胞已經(jīng)充分經(jīng)過血液循環(huán)運行于全身，并發(fā)揮其攜氧功能，一定程度上可以代表紅細(xì)胞經(jīng)過血液回收機后近期形態(tài)和功能的變化，但遠(yuǎn)期紅細(xì)胞的功能維持及壽命的變化，可能需要術(shù)后更加長時間的觀察，甚至將回輸血進行針對性的標(biāo)記，能夠使后期的追蹤更加準(zhǔn)確。

雖然洗滌過程可除去紅細(xì)胞碎片，但對那些功能已經(jīng)發(fā)生障礙而尚能維持細(xì)胞完整形態(tài)的紅細(xì)胞卻不能完全除去，這部分紅細(xì)胞可能在體內(nèi)循環(huán)過程中受到一些剪切力的作用進一步變形甚至破碎形成紅細(xì)胞碎片，釋放出血紅蛋白，這會危害組織的灌注。造成紅細(xì)胞這種變形和破壞的主要因素，可能是自體血收集和回輸過程中紅細(xì)胞與管道和回收裝置表面接觸，血液回收機運轉(zhuǎn)期間高速離心、泵管擠壓、負(fù)壓吸引、肝素抗凝、生理鹽水沖洗、血氣界面損傷及與高分子聚和物接觸等因素所致，同時組織細(xì)胞損傷后釋放的各種細(xì)胞因子，以及組織碎片、炎性介質(zhì)、凝血因子、血小板和白細(xì)胞等因子在接觸內(nèi)皮下表面、氣血界面、人工合成材料時也被激活，從而加重紅細(xì)胞損害。這些因素作用于紅細(xì)胞使其膜電壓發(fā)生改變，Ca2+－ATPase活性降低，增加了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。鈣超載使紅細(xì)胞膜喪失其柔韌應(yīng)變的性質(zhì)，變得僵硬，降低可塑性，使原雙凹圓盤形紅細(xì)胞變成有很多短的有規(guī)則突起的球狀體－棘狀細(xì)胞［13］。回收血使用生理鹽水清洗后，回收血中各主要離子成份除鈉離子、氯離子外均明顯減少，鉀、鎂、鈣等離子濃度均不足正常生理水平的50%，存在高鈉、高氯、低鉀情況。較多的Na+進入細(xì)胞內(nèi)，超過了離子泵的代償能力，導(dǎo)致細(xì)胞的腫脹，嚴(yán)重時發(fā)生紅細(xì)胞破裂。上述紅細(xì)胞變形能力和形態(tài)都會有明顯改變，由此可見紅細(xì)胞破壞和功能異常的關(guān)鍵在于細(xì)胞膜鈣泵(Ca2+－ATPase)和鈉泵(Na+－K+－ATPase)的運轉(zhuǎn)異常，造成細(xì)胞內(nèi)Na+升高及Ca2+超載，導(dǎo)致紅細(xì)胞變形能力降低和血液流變學(xué)變化［14－15］。

AFM可以顯示出紅細(xì)胞膜表面是由大小不同的顆粒狀物質(zhì)的密集排列的凹凸表面，凸出的顆粒狀物質(zhì)直徑大多小于50 nm，表面起伏只有幾個納米［16］，有研究認(rèn)為顆粒狀物質(zhì)是各種膜外周蛋白，凹陷區(qū)域?qū)?yīng)于細(xì)胞膜的脂質(zhì)區(qū)［17］，這些膜蛋白顆粒分別作為易化擴散所需的載體和離子通道。本研究結(jié)果表明，回收未處理血紅細(xì)胞膜表面顆粒分布紊亂，堆積型條索狀隆起與凹陷，呈不典型的多聚體與單體雜亂分布的顆粒及孔洞形貌，是蛋白分子聚集體不能解聚的結(jié)果。Ra與Rq能夠反映細(xì)胞膜表面的粗糙程度，洗滌前紅細(xì)胞膜表面粗糙度高于其余時點的紅細(xì)胞。紅細(xì)胞膜為液態(tài)鑲嵌模型，以磷脂雙分子層為基質(zhì)，其內(nèi)鑲嵌蛋白質(zhì)分子。作為膜骨架結(jié)構(gòu)的磷脂雙分子層大部分以液態(tài)形式存在，球蛋白分子部分鑲嵌于脂雙層內(nèi)，部分突出于脂雙層表面，這些球蛋白分子可在脂雙層上移動。蛋白分子通過疏水鍵與磷脂分子的親水端結(jié)合，正常情況下蛋白分子不會發(fā)生聚集。血液回收時由于負(fù)壓吸引、空吸及清洗等可改變回收血紅細(xì)胞膜磷脂雙分子骨架結(jié)構(gòu)，使紅細(xì)胞膜表面散在分布的蛋白分子發(fā)生聚集而形成較大的聚集體，出現(xiàn)以上紅細(xì)胞膜分子結(jié)構(gòu)中蛋白分子形貌學(xué)及紅細(xì)胞膜表面粗糙度的變化。因此，回收血紅細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，其形態(tài)學(xué)改變可影響紅細(xì)胞的功能。細(xì)胞膜的穩(wěn)定性在很大程度上依賴于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)β螺旋的穩(wěn)定。但是張東等［18］研究發(fā)現(xiàn)膜蛋白的二級結(jié)構(gòu)不是造成回收血紅細(xì)胞形態(tài)變化的主要原因，并且李西慧等［19］回收血的紅細(xì)胞P50與正常值接近，認(rèn)為對紅細(xì)胞攜氧能力無明顯影響。

綜上所述，自體血液回收導(dǎo)致患者紅細(xì)胞AFM形貌及膜表面超微結(jié)構(gòu)改變，其程度是否影響紅細(xì)胞功能，以及回輸后紅細(xì)胞長期生存狀況，還有待進一步探討。

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