余慕雪，沈振宇△，莫清萍，丘小汕

(1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科，廣東 廣州 510080;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)兒科，廣東 廣州 510700)

小于胎齡(small for gestational age，SGA)是指出生體重和(或)身長在同胎齡標(biāo)準(zhǔn)參照群體-2倍標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)以下［1］。SGA 的遠期可發(fā)生糖代謝障礙，導(dǎo)致機體胰島素敏感性下降［2］，相關(guān)機制尚不明確。生長追趕學(xué)說［2］認(rèn)為隨著SGA宮外營養(yǎng)狀態(tài)改善，在體格追趕生長的過程中可致體脂成分增加，而體脂增加與胰島素抵抗發(fā)生有關(guān)。脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪組織合成和分泌的一種改善機體胰島素敏感性的激素蛋白質(zhì)。體脂積聚過程中，脂聯(lián)素負反饋抑制脂肪組織脂聯(lián)素的形成和分泌［3］。脂聯(lián)素-AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信號通路是脂肪-肌肉軸［4］中的一條與機體糖代謝相關(guān)的主要信號通路。體外研究［5］表明活化AMPK可促進胰島素信號通路效應(yīng)分子葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)的表達，改善骨骼肌對糖的利用，但是目前尚無脂聯(lián)素-AMPK信號通路在SGA個體的研究報道。阻止SGA胰島素抵抗的發(fā)生，是降低成年期代謝綜合征易患性風(fēng)險的關(guān)鍵。高蛋白飲食對高脂喂養(yǎng)肥胖大鼠的體脂和糖代謝有改善［6］;同樣我們的前期研究［7］顯示SGA大鼠早期高蛋白飲食后恢復(fù)正常飲食，能減少體脂成分和避免胰島素抵抗的發(fā)生，高脂高熱卡飲食則使體脂增多，并放大了胰島素抵抗的效應(yīng)，高蛋白等熱卡飲食是營養(yǎng)干預(yù)一個較好的飲食結(jié)構(gòu)。本研究旨在研究SGA脂聯(lián)素-AMPK信號通路的變化及其在高蛋白飲食對SGA大鼠糖代謝影響的作用，為SGA胰島素抵抗的早期防治提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物飼料 參考AIN93-G飼料成分配制基礎(chǔ)飼料［8］，能量為3948 kcal/kg，可利用蛋白質(zhì)能量占基礎(chǔ)飼料總能量的20%;高蛋白飼料能量與基礎(chǔ)飼料成分一致，在基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上增加可利用酪蛋白100 g/kg diet、減少淀粉100 g/kg diet，可利用蛋白質(zhì)能量占高蛋白飼料總能量的30%。

1.2 主要試劑 血糖試劑盒購于上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司。胰島素試劑盒購于中國同位素公司。脂聯(lián)素試劑盒購于Millipore。PMSF、RIPA(P0013B)裂解液購于碧云天生物技術(shù)研究所。BCA法蛋白定量檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。AMPKα (23A3)rabbit mAb、phospho-AMPKα (Thr172)(40H9)rabbit mAb、GLUT4(1F8)mouse mAb、辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG和辣根過氧化酶標(biāo)記馬抗小鼠IgG購于Cell Signaling。小鼠抗GAPDH單克隆抗體購于上海康成生物公司。

2 方法

2.1 SGA大鼠動物模型建立 廣東省醫(yī)學(xué)動物中心提供SPF級Sprague-Dawley大鼠。雌、雄性大鼠2∶1合籠自然交配，交配后雌性大鼠陰道涂片，發(fā)現(xiàn)精子視為妊娠第1 d，然后雌性孕鼠分籠喂養(yǎng)。正常對照組孕鼠受孕后基礎(chǔ)飼料自由飲食，平均每天進食飼料(25±2)g;SGA模型組孕鼠，受孕后第1 d始限制飲食，以自由飲食雌性孕鼠前1 d食量的約40%為進食量，平均每天進食基礎(chǔ)飼料(10±0.5)g，待自然分娩。正常母鼠分娩的正常新生雄鼠24只為正常對照組(CN組)。SGA模型組孕鼠分娩鼠仔出生體重和身長低于正常對照組孕鼠分娩鼠仔-2SD以下者為SGA大鼠。48只SGA新生雄鼠出生時隨機分為SGA對照組(CS組)、SGA高蛋白質(zhì)組(HPS組)各24只。哺乳期所有分組的鼠仔每窩控制為8只，保留符合條件的雄性鼠仔，不足8只雄性鼠仔則保留部分符合條件的雌性鼠仔。

2.2 動物分組和處理

2.2.1 動物分組和飼養(yǎng) CN和CS組大鼠，0～3周哺乳期母鼠予以基礎(chǔ)飼料自由飲食，斷乳后幼鼠再予以基礎(chǔ)飼料自由飲食至滿12周齡;HPS組大鼠，0～3周哺乳期母鼠予以高蛋白飼料自由飲食，斷乳后幼鼠再予以高蛋白飼料1周，4周齡(相當(dāng)于人類兒童期)后予基礎(chǔ)飼料自由飲食至滿12周齡(相當(dāng)于人類成年期)。

2.2.2 動物處理 4周齡時，各組12只大鼠禁食12 h，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，眼眶靜脈叢取血1～2 mL，血標(biāo)本立即離心吸取血清;開腹分離雙側(cè)腎周和附睪脂肪組織稱重，分離大鼠右后肢股二頭肌骨骼肌組織，所有組織-80℃冷凍保存。12周齡時，各組12只大鼠禁食12 h，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，眼眶靜脈叢取血1～2 mL，血標(biāo)本立即離心吸取血清;然后各組隨機取6只大鼠行口服糖耐量試驗(oral glucose tolance test，OGTT)，予50%葡萄糖(5 mL/kg)灌胃，分別于灌胃后30、60、120 min眼眶靜脈叢取血1 mL，血標(biāo)本立即離心吸取血清;次日各組12只大鼠禁食12 h后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，開腹分離雙側(cè)腎周和附睪脂肪組織稱重，分離大鼠右后肢股二頭肌骨骼肌組織，所有組織-80℃冷凍保存。

2.3 各指標(biāo)檢測方法和計算

2.3.1 血清學(xué)指標(biāo)檢測 眼眶靜脈叢取血后血標(biāo)本立即離心，吸取血清，馬上采用氧化酶-過氧化物酶法在全自動生化分析儀上檢測血糖;其余置于-80℃冰箱儲存，取空腹血清統(tǒng)一放射免疫法檢測胰島素水平、酶聯(lián)免疫吸附法檢測脂聯(lián)素水平。

2.3.2 計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment model for insulin resistance，HOMA-IR)HOMA-IR=空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5［9］。

2.3.3 OGTT血糖曲線下面積(area under the curve，AUC) 采用梯形面積法［10］計算。

2.3.4 內(nèi)臟脂肪計算 內(nèi)臟脂肪質(zhì)量(visceral fat mass，VFM)為雙側(cè)腎周脂肪與附睪脂肪質(zhì)量之和。計算內(nèi)臟脂肪體重百分比(VFM%)。VFM%=VFM(g)/體重(g)×100%。

2.3.5 脂肪細胞面積計算 每組隨機抽取8只大鼠的附睪脂肪組織標(biāo)本，甲醛固定后石蠟包埋切片、常規(guī)HE染色。Olympus BX60顯微鏡下采用Image-Pro Plus 5.1中文版軟件進行圖像分析，同一標(biāo)本在400倍高倍顯微鏡下任選10個視野，測量每個視野的脂肪細胞面積，取算術(shù)平均值為該標(biāo)本的內(nèi)臟脂肪細胞面積。

2.3.6 骨骼肌AMPKα、p-AMPKα和GLUT4蛋白測定 用Western blotting法。提取骨骼肌蛋白后，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。孵育Ⅰ抗:加入用4%BSA/TBS溶液稀釋的濃度為1∶500的AMPK、p-AMPK、GLUT4Ⅰ抗以及1∶8000的 GAPDH Ⅰ抗，用塑料膜封閉后置冷庫孵育過夜。用1×TBST洗膜10 min×3次。孵育Ⅱ抗:將膜浸泡于用5%的脫脂奶粉/TBST溶液按照1∶2000配制的辣根過氧化酶標(biāo)記的抗兔或抗小鼠的Ⅱ抗，室溫下孵育60 min，用1×TBST洗膜10 min×3次。使用ODYSSEY紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描圖像并進行灰度分析。半定量分析各檢測骨骼肌靶蛋白和內(nèi)參照GAPDH的含量，分別計算各個實驗組與同周齡正常對照組檢測蛋白的表達相對量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 體重和內(nèi)臟脂肪體重百分比

表1顯示，CN組新生雄鼠的出生體重顯著高于CS組和HPS組(均P＜0.01)，CN組和HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。4周齡時CS組體重顯著低于CN組和HPS組(均P＜0.05)，而CN組與HPS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。12周齡時各組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。4和12周齡時CS組VFM%顯著高于CN組和HPS組(均P＜0.01)，CN組和 HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2 內(nèi)臟脂肪細胞面積

4和12周齡CS組大鼠內(nèi)臟脂肪細胞面積顯著大于CN組和HPS組(均P＜0.01)，而CN組和HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1。

表1 各組大鼠4和12周齡體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪體重百分比Table 1.Body weight，visceral fat mass(VFM)and body visceral fat mass percentage(VFM%)at 4 and 12 weeks of age()

表1 各組大鼠4和12周齡體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量和內(nèi)臟脂肪體重百分比Table 1.Body weight，visceral fat mass(VFM)and body visceral fat mass percentage(VFM%)at 4 and 12 weeks of age()

CN:normal control;CS:SGA control;HPS:high-protein intervention SGA group.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CN group;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs CS group.

4 weeks(n=12)Group Birth(n=24)12 weeks(n=12)Body weight(g) Body weight(g) VFM(g) VFM% Body weight(g) VFM(g) VFM%CN 7.06±0.41 84.19±7.92 0.485±0.117 0.578±0.138 425.98±23.06 7.686±0.944 1.800±0.176 CS 5.04±0.31＊＊ 76.20±8.93* 0.604±0.101* 0.793±0.107＊＊ 429.70±19.53 15.360±1.504＊＊ 3.577±0.325＊＊HPS 5.05±0.24＊＊ 84.13±8.45# 0.497±0.111# 0.594±0.136## 425.12±24.57 7.587±1.104## 1.781±0.209##

Figure 1.Adipocyte area of visceral fat at 4 weeks(A)and 12 weeks(B)of age..n=8.＊＊P＜0.01 vs CN group;##P＜0.01 vs CS group圖1 各組大鼠4和12周齡內(nèi)臟脂肪細胞面積

3 糖代謝和血清脂聯(lián)素水平

4周齡各組大鼠HOMA-IR差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。12周齡CS組HOMA-IR顯著高于CN組和HPS組(均P＜0.01)，CN組和HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。4和12周齡血清脂聯(lián)素水平CS組低于CN組和HPS組(P＜0.05或P＜0.01)，CN組和 HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表 2。

表2 各組大鼠4和12周齡空腹血糖、胰島素、HOMA－IR和脂聯(lián)素水平Table 2.Fasting blood glucose，insulin，HOMA-IR and serum adiponectin levels at 4 and 12 weeks of age(.n=12)

表2 各組大鼠4和12周齡空腹血糖、胰島素、HOMA－IR和脂聯(lián)素水平Table 2.Fasting blood glucose，insulin，HOMA-IR and serum adiponectin levels at 4 and 12 weeks of age(.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs CN group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs CS group.

4 weeks HOMA-IR Adiponectin(mg/L)CN 5.13±0.60 5.41±0.96 1.23±0.20 7.766±0.52 Group 12 weeks Glucose(mmol/L)Insulin(mU/L)HOMA-IR Adiponectin(mg/L)Glucose(mmol/L)Insulin(mU/L)3 5.41±0.83 7.30±0.58 1.76±0.36 5.839±0.587 CS 5.17±0.72 5.48±0.98 1.26±0.32 6.825±0.639＊＊ 5.64±0.78 9.31±0.72＊＊ 2.34±0.46＊＊ 4.741±0.613＊＊HPS 5.04±0.51 5.57±1.00 1.24±0.26 7.493±0.652# 5.32±0.75 7.21±0.79## 1.72±0.38## 5.784±0.676##

12周齡大鼠OGTT見圖2，各組空腹血糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，血糖高峰期均在30 min，30 min血糖CS組顯著高于CN組(P＜0.01)和HPS組(P＜0.05)，CN組和HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);各組之間60、90、120 min血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);OGTT中血糖AUC見圖3，CS組顯著高于CN組和HPS組(均P＜0.05)，CN組和HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

4 骨骼肌AMPKα和磷酸化AMPKα的表達

各組大鼠骨骼肌AMPKα和p-AMPKα的表達見圖4。4和12周齡時各組骨骼肌AMPKα表達的相對量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);p-AMPKα的表達相對量CS組低于CN組和 HPS組(均 P＜0.01)，CN組和 HPS組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

5 骨骼肌GLUT4的表達

4和12周齡時CS組大鼠骨骼肌GLUT4蛋白表達的相對量顯著低于 CN組和 HPS組(均 P＜0.01)，而CN組和HPS組骨骼肌GLUT4表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)，見圖5。

Figure 2.Blood glucose in response to OGTT in rats at 12 weeks of age..n=6.＊＊P＜0.01 vs CN group;#P＜0.05 vs CS group.圖2 各組大鼠12周齡OGTT血糖改變

Figure 3.Areas under the curves(AUC)of blood glucose in response to OGTT in rats at 12 weeks of age..n=6.*P＜0.05 vs CN group;#P＜0.05 vs CS group圖3 各組大鼠12周齡OGTT血糖曲線下面積

Figure 4.AMPKα and p-AMPKα expression in skeletal muscle of rats at 4 weeks(A)and 12 weeks(B)of age..n=6.＊＊P＜0.01 vs CN group;##P＜0.01 vs CS group.圖4 各組大鼠4和12周齡骨骼肌AMPKα和p－AMPKα的表達

Figure 5.GLUT4 expression in skeletal muscle of rats at 4 weeks(A)and 12 weeks(B)of age..n=6.＊＊P＜0.01 vs CN group;##P＜0.01 vs CS group.圖5 各組大鼠4和12周齡骨骼肌GLUT4的表達

討 論

糖代謝障礙是胰島素抵抗的基礎(chǔ)，胰島素抵抗導(dǎo)致機體胰島素介導(dǎo)的葡萄糖代謝能力下降［11］。GLUT4是胰島素和非胰島素信號通路共同的下游效應(yīng)分子，表達于對胰島素敏感的組織(如肌肉和脂肪組織)中，其從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜，實現(xiàn)葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運［12］。骨骼肌在維持機體糖代謝中起重要作用，胰島素刺激后的糖攝取85%由骨骼肌完成，骨骼肌GLUT4的表達、從胞漿移位到細胞膜是糖攝取的主要過程［11］。GLUT4表達障礙可致機體糖代謝異常的發(fā)生［12］。本研究12周齡SGA大鼠HOMA-IR增高，OGTT顯示其糖代謝異常;4周齡SGA大鼠未見HOMA-IR改變，推測與SGA大鼠脂肪組織快速增長過程中，利用糖增多，糖由肌肉組織轉(zhuǎn)移到脂肪組織，且骨骼肌糖攝取障礙時，肝臟可以發(fā)揮部分代償作用［13］等有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)4和12周齡SGA大鼠骨骼肌 GLUT4表達下調(diào)，可能與脂聯(lián)素 -AMPK通路活化受損、下調(diào)其下游效應(yīng)分子GLUT4表達有關(guān)，而早期予SGA大鼠高蛋白飲食則上調(diào)脂聯(lián)素-AMPK通路，提高骨骼肌GLUT4表達，改善其糖代謝。

SGA有關(guān)GLUT4上游信號通路研究大部分集中在胰島素信號通路磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidy linositol 3-kinase，PI3K)途徑的研究。Oak等［14］研究示SGA成年大鼠骨骼肌PI3K途徑中的遠端關(guān)鍵分子蛋白激酶Cζ活化減弱是肌肉組織對外源性胰島素發(fā)生抵抗的主要原因;而Jensen等［15］對SGA青年男性骨骼肌活檢檢測示PI3K途徑中蛋白激酶B磷酸化水平低下。我們的研究顯示SGA大鼠骨骼肌GLUT4表達下降，與非胰島素信號通路脂肪-肌肉軸中脂聯(lián)素-AMPK通路活化受損有關(guān)。AMPK是脂聯(lián)素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的重要聯(lián)系分子。AMPK是一個異三聚體蛋白，α亞單位中的蘇氨酸172位點磷酸化對AMPK活性的調(diào)節(jié)起重要作用。除了AMP/ATP比值升高是激活A(yù)MPK的經(jīng)典途徑外，脂聯(lián)素參與了AMPK信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)［16］。脂聯(lián)素通過激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)糖代謝，骨骼肌中脂聯(lián)素-AMPK信號通路通過脂聯(lián)素受體1相結(jié)合蛋白/LKB1和磷脂酶C/Ca2+/Ca2+調(diào)鈣蛋白依賴性蛋白激酶的激酶通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，使AMPK磷酸化［17］。Tomas等［18］在大鼠肌肉中加入脂聯(lián)素，AMPK活化及糖攝取增加?；罨腁MPK可以使組蛋白去乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)5中259和498位的絲氨酸磷酸化，調(diào)節(jié)HDAC5與肌細胞加強因子2的結(jié)合狀態(tài)上調(diào)GLUT4的表達［5］。此外，活化的AMPK使乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)磷酸化，抑制ACC的活性，促進細胞脂肪酸氧化，減少游離脂肪酸含量［19］，而體外骨骼肌細胞培養(yǎng)加入游離脂肪酸可以通過降低生長因子受體結(jié)合蛋白2、細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶2、絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1信號蛋白表達，使骨骼肌細胞GLUT4的基因和蛋白表達下降［20-22］。

本研究中，SGA大鼠出生后追趕生長時伴有內(nèi)臟脂肪增多，脂肪細胞增大，而血清脂聯(lián)素水平降低。宮內(nèi)營養(yǎng)不良SGA個體出生體脂成分少于正常出生體重個體［23］，SGA個體生后營養(yǎng)供應(yīng)增加時，脂肪組織保持宮內(nèi)低產(chǎn)熱狀態(tài)，骨骼肌保持宮內(nèi)糖利用減少的狀態(tài)，出現(xiàn)脂肪和肌肉組織之間能量和葡萄糖的轉(zhuǎn)移和再分配，更多的能量和葡萄糖糖由肌肉組織轉(zhuǎn)移到脂肪組織［24］。Isganaitis等［25］研究示SGA脂肪細胞ACC和脂肪酸合成酶等表達增高使脂肪細胞增大。在脂肪細胞形成時，脂聯(lián)素合成增加，在體脂過多積聚過程中，負反饋抑制脂聯(lián)素的形成和分泌［3］。臨床和動物實驗研究顯示肥胖個體血清脂聯(lián)素水平低下而減肥或體脂水平下降后血清脂聯(lián)素水平上升［26］。

在肥胖成年人的研究中，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等藥物可用于增加脂肪組織脂聯(lián)素的分泌，通過運動、飲食等方式控制體重、減少體脂成分也能提高血清脂聯(lián)素水平［27］。脂聯(lián)素參與AMPK信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，并為目前治療胰島素抵抗、改善機體糖代謝的靶點之一［16］。Hoenig等［28］予以肥胖個體高蛋白飲食后體脂減少，血脂聯(lián)素上升，機體胰島素敏感性有改善;Pasarica等［29］對肥胖糖尿病成人予以運動、低熱卡飲食1年，其體脂成分減少、脂肪細胞體積減少，伴血清脂聯(lián)素水平上升和胰島素敏感性改善。Polson等［30］予以大鼠高蛋白低脂飲食后脂肪組織脂聯(lián)素基因表達增加。我們的研究增加飲食中蛋白/能量比，防止SGA宮外生長過程中體脂過多積聚，且早期高蛋白飲食改善SGA大鼠血清脂聯(lián)素水平及機體糖代謝。SGA大鼠經(jīng)早期高蛋白營養(yǎng)干預(yù)，4和12周齡時骨骼肌GLUT4表達上調(diào)，推測高蛋白干預(yù)上調(diào)其脂聯(lián)素-AMPK信號通路。

綜上所述，早期SGA高蛋白營養(yǎng)干預(yù)可能是通過脂聯(lián)素-AMPK信號通路提高 GLUT4表達，達到改善糖代謝的作用。

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