夏金明,胡春林,李 欣,李 慧,魏紅艷,李穎慶,廖曉星,荊小莉△
(1中山大學附屬第一醫(yī)院急診科,廣東 廣州 510080;2杭州師范大學附屬醫(yī)院急診科,浙江 杭州 310015)
隨著人口老齡化,心腦血管病已經成為當今社會最主要、最常見的疾病之一,心臟性猝死(sudden cardiac death,SCD)也隨之成為中老年患者死亡的重要原因,而有效的心肺復蘇(cardiopulmonary resus-citation,CPR)是成功搶救這類患者的首要步驟。盡管由于CPR新指南的出臺、復蘇技術的發(fā)展和公眾CPR技術的普及,SCD病人的自主循環(huán)恢復(return of spontaneous circulation,ROSC)率得到了顯著提高,成功率可達20%~50%[1],然而僅有2%~15%的病人能存活出院[2],大多數病人死于CPR后全腦缺血缺氧導致的神經元損傷,即使幸免存活者,其中40%~50%也伴有不同程度的神經功能障礙和缺失[3]。因此,腦復蘇是CPR成功的關鍵。
氧化應激損傷是CPR后腦損傷的主要機制之一[4],而核因子 E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是機體對抗氧化應激最重要的細胞防御機制[5]。Nrf2通過與胞漿蛋白 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrinassociated protein 1,KEAP1)以及抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)相互作用,啟動下游編碼抗氧化蛋白和 II相解毒酶的基因表達,發(fā)揮細胞保護作用[6]。我們前期的研究表明烏司他丁(ulinastatin,UTI)可減輕 CPR 后腦損傷[7],但其具體機制還不清楚。本文從UTI對CPR后氧化應激的影響探討UTI的腦保護作用機制,類似研究國內外還未見報道。
56只雄性新西蘭成年大白兔,由中山大學實驗動物中心提供。動物購進后飼養(yǎng)1周,實驗前晚禁食不禁水。實驗1:8只新西蘭兔建立CA模型,ROSC后24 h內連續(xù)采血監(jiān)測血漿丙二醛(malondialdehyde,MDA)和還原型谷胱甘肽 (glutathione,GSH)水平。實驗2:48只新西蘭兔建立CA模型,ROSC后隨機分為模型組(model組)和UTI組,每組分別于ROSC后2 h、4 h和8 h取大腦皮層和海馬,測定MDA和GSH含量,檢測Nrf2激活情況;其余動物存活72 h后取大腦皮層和海馬,TUNEL法檢測原位細胞凋亡。
MDA和GSH測定試劑盒購自南京建程生物工程研究所;TUNEL凋亡試劑盒購自Roche;BCA法蛋白定量試劑盒、核/胞漿蛋白提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司;戊巴比妥鈉購自Sigma;Nrf2試劑盒購自Abcam;UTI購自廣州天普生化醫(yī)藥股份有限公司。小動物呼吸機(RODENT VENTILATOR 683.Harvard Apparatus);4道生理信號采集分析系統(tǒng)(BIOPAC SYSTEMS MAP150,Inc.MP100A -CE Santa Barbara);動物除顫儀(SAN-ei Cardiopace 3MII)。
3.1 術前準備 戊巴比妥鈉(30 mg/kg)經兔左耳緣靜脈注入,麻醉成功后,胸部備皮。選擇3.0號氣管導管經口氣管插管,常規(guī)Ⅱ導聯心電監(jiān)護,小號留置針穿刺右耳動脈,接高敏感換能器監(jiān)測動脈血壓。心電圖和動脈血壓通過4道生理信號采集分析系統(tǒng)連續(xù)記錄在電腦上。
3.2 建立CPR模型 按照本課題組前期的研究方法建立室顫-CPR模型[8-10]。采用經胸體表交流電(6 V,50 Hz)誘發(fā)室顫,誘發(fā)時間5~10 s。成功誘發(fā)室顫的標準為:心電監(jiān)護顯示室顫波形,血壓迅速下降,接近0 mmHg。室顫持續(xù)5 min后開始CPR,行心前區(qū)胸外心臟按壓,頻率為200次/min,深度為胸腔前后徑的1/3;同時接呼吸機,通氣頻率為45次/min,潮氣量約10 mL/kg(根據血氣分析結果調整呼吸機參數,使PCO2控制在35~45 mmHg之間)。復蘇期間每3 min給予腎上腺素20 μg/kg。按壓2 min后給予電除顫,選擇能量為20~30 J。如15 min未恢復自主循環(huán),終止實驗。判斷ROSC成功的標準為:恢復自主心律,平均動脈壓大于60 mmHg并持續(xù)30 min以上。UTI組動物ROSC后立即給予UTI 10×104U/kg一次性經左耳緣靜脈注入,而model組只給予等體積的生理鹽水注入。ROSC后維持實驗動物平均動脈血壓大于60 mmHg,補充生理需要的能量。ROSC后所有動物維持機械通氣2~3 h,斷開呼吸機后如呼吸節(jié)律規(guī)則且血流動力學穩(wěn)定,并持續(xù)1 h以上,停機械通氣。ROSC后不予以維持麻醉。所有實驗數據按照UTSTEIN模式記錄。
3.3 血漿MDA和GSH水平測定 實驗1組動物分別于復蘇前、ROSC 后 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、5 h、7 h、9 h、12 h、18 h 和 24 h 從左耳緣靜脈采血,離心后取上清用硫代巴比妥酸(thibabituric acid,TAB)法測定血漿MDA,用二硫代二硝基苯甲酸[5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid),DTNB]法測定GSH。
3.4 腦組織MDA和GSH含量測定 ROSC后2 h、4 h和8 h 3個時點各取4只兔并取其大腦皮層和海馬,組織勻漿后用BCA法測定勻漿蛋白濃度,并測定MDA和GSH含量,計算出每毫克組織中MDA和GSH的含量。
3.5 Western blotting檢測Nrf2蛋白水平 處理不同時段腦組織凍存標本,按照核/胞漿蛋白提取試劑盒說明,提取胞漿蛋白和核蛋白,BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,按濕轉法將電泳產物轉移到PVDF膜,5%的脫脂奶粉封閉2 h,滴加Ⅰ抗(1∶1000)4℃過夜,TBST洗膜,5 min×3次,滴加HRB標記的Ⅱ抗(1∶3000)室溫下孵育1 h,TBST洗膜,5 min×3次,Milipore發(fā)光液浸泡1 min,Koda膠片曝光,顯影、定影,計算蛋白灰度。
3.6 腦組織凋亡神經元計數 ROSC后72 h過量麻醉處死動物,取大腦皮層和海馬組織,用4%甲醛固定,做石蠟切片后TUNEL法原位細胞凋亡檢測,在光鏡400倍視野下,計數100×100像素內凋亡細胞數。
將數據錄入SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,依據正態(tài)檢驗(Kolmogorov-Smirnov)結果數據分別用均數±標準差()或中位數(第1四分位數,第3四分位數)表示,用t檢驗或秩和檢驗(Mann-Whitney rank),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
實驗1中8只動物,均致顫成功,有6只存活至ROSC后24 h。實驗2中48只動物,均致顫成功,ROSC后2、4和8 h,每組各時點均分別處死4只動物,取材。Model組和UTI組各有6只存活到ROSC后72 h。2組動物的生理學參數如體重(body weight,BW)、心率(heart rate,HR)、呼吸頻率(respiratory rate,RR)、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)和復蘇相關的指標如基礎生命支持時間(basic life support,BLS)、除顫次數(defibrillation times,DF-T)、腎上腺素(adrenaline,AD)用量之間沒有顯著差異,見表1、2。
表1 2組動物CPR前一般生理參數Table 1.Physiological parameters in the two groups before CPR(.n=18)
表1 2組動物CPR前一般生理參數Table 1.Physiological parameters in the two groups before CPR(.n=18)
Group BW(kg) HR(min-1) RR(min-1) MAP(mmHg)Model 2.39±0.33 251.37±51.37 43.32±4.68 83.83±17.98 UTI 2.43±0.19 270.73±28.31 42.45±5.39 84.63±10.11
表2 2組動物CPR相關指標Table 2.CPR-related indicators in the two groups(.n=18)
表2 2組動物CPR相關指標Table 2.CPR-related indicators in the two groups(.n=18)
Group BLS(min) DF-T AD(μg)Model 2.16 ±1.81 1(0,2)126.53 ±63.04 UTI 2.56 ±1.25 1(0,2)132.91 ±59.52
ROSC后血漿MDA迅速升高,在ROSC后1.5~2 h左右達到峰值水平(195.51±23.57)μmol/L,見圖1A,ROSC后血漿GSH明顯下降,在ROSC后2 h達到最低谷[(69.89±14.53)mmol/L],見圖1B。
Figure 1.The changes of plasma MDA(A)and GSH(B)levels in 24 h after ROSC..n=6.圖1 ROSC后24 h內血漿MDA和GSH的變化
ROSC后2 h、4 h和8 h 3個時點2組動物大腦皮層與海馬MDA含量見表3,結果發(fā)現UTI組ROSC后腦組織MDA含量明顯低于model組,2組差異有統(tǒng)計學意義。
表3 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織MDA含量Table 3.The concentration of MDA in rabbit brain tissues at 2 h,4 h and 8 h after ROSC[μmol/(g protein)..n=4]
表3 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織MDA含量Table 3.The concentration of MDA in rabbit brain tissues at 2 h,4 h and 8 h after ROSC[μmol/(g protein)..n=4]
*P <0.05,** P <0.01 vs model group.
Hippocampus 2 h 4 h 8 h 2 h 4 h 8 h Model 17.28 ±1.43 14.75 ±1.20 12.12 ±1.24 17.1 Group Cortex 9 ±1.35 13.42 ±4.27 12.21 ±1.83 UTI 13.05 ±1.25** 11.51 ±0.68** 8.71 ±0.92** 13.02 ±1.19** 10.95 ±1.00* 7.59 ±1.92**
ROSC后2 h、4 h和8 h 3個時點2組動物大腦皮層與海馬GSH含量見表4,UTI組ROSC后腦組織GSH含量明顯高于model組,2組間差異有統(tǒng)計學意義。
表4 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織GSH含量Table 4.The concentration of GSH in rabbit brain tissues at 2 h,4 h and 8 h after ROSC[mmol/(g protein)..n=4]
表4 ROSC后2 h、4 h和8 h兔腦組織GSH含量Table 4.The concentration of GSH in rabbit brain tissues at 2 h,4 h and 8 h after ROSC[mmol/(g protein)..n=4]
** P <0.01 vs model group.
Hippocampus 2 h 4 h 8 h 2 h 4 h 8 h Model 1.97 ±0.58 1.59 ±0.36 1.22 ±0.24 2.22 ±0.Group Cortex 74 1.76 ±0.72 1.02 ±0.34 UTI 4.36 ±1.00** 3.61 ±0.86** 3.05 ±0.90** 4.59 ±0.53** 3.88 ±0.36** 3.13 ±0.32**
Western blotting檢測結果顯示,ROSC后2、4和8 h model組胞核/胞漿Nrf2蛋白表達分別為0.91±0.08、0.87±0.04和 0.79±0.09,明顯低于同時段UTI組(1.07±0.06、1.04±0.09和0.98±0.07,均P <0.05),見圖2。
Figure 2.The expression of Nrf2 in the cortex of rabbits after ROSC..n=4.*P<0.05 vs model group.圖2 ROSC后兔大腦皮層Nrf2蛋白的表達
ROSC后72 h 2組大腦皮層凋亡神經元數目model組為8.8±1.5,UTI組為5.7±1.0,P <0.01。海馬CA1~CA3區(qū)model組凋亡神經元數目分別為17.2±1.2、13.5 ±2.1和17.3±2.7,明顯多于 UTI組(14.2±1.5、11.0±0.9和13.7±1.6,P<0.05或P <0.01),見圖3。
Figure 3.The apoptosis of neurons in cortex and hippocampus CA1~CA3 areas after ROSC 72 h(TUNEL staining,×400)..n=6.*P <0.05,**P <0.01 vs model group.圖3 ROSC后72 h大腦皮層和海馬CA1~CA3區(qū)神經元凋亡情況
CA后機體血液循環(huán)近乎停止,全身各臟器和組織處于極為嚴重的缺血缺氧狀態(tài),經過有效及時的心肺復蘇,ROSC后全身血運得以重建,但機體又將會面臨新的傷害,即再灌注損傷[11]。大腦血液循環(huán)豐富,耗氧量也是全身最多的器官,因此CA會對腦組織產生極為嚴重的影響和后果,而神經元損傷會選擇性出現在一些對缺血再灌注極為敏感的腦區(qū),如海馬、丘腦網狀核和大腦皮層[3]等部位,而氧化應激損傷則是CPR后繼發(fā)性腦損傷的主要機制之一[4]。
氧自由基會引起生物體內尤其是腦組織蛋白質、核酸和脂質過氧化損傷[12],導致體內氧化與抗氧化作用平衡失調,產生MDA等大量過氧化降解產物,破壞細胞膜,引起線粒體和內質網結構和功能改變,加重細胞能量代謝障礙,反過來促進新自由基的產生,周而復始,最終導致了神經元凋亡和壞死[13]。氧自由基還可使細胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor 1,Apaf-1)等釋放增加,通過多條途徑導致神經元凋亡[3]。
在實驗1中我們發(fā)現新西蘭兔歷經5 min的室顫以及隨后2~5 min的CPR,自主循環(huán)恢復后血漿中MDA明顯增高,在ROSC后2 h達到峰值水平,而體內重要的抗氧化劑GSH在CPR后有所下降,在ROSC后2 h達到最低谷。上述結果表明CA后機體出現了明顯的氧化應激損傷,氧化產物大量產生,抗氧化物質明顯減少,兩者之間動態(tài)平衡被完全打破。因此,盡早干預ROSC后的失控性氧化應激損傷可能會給CA病人帶來益處。
UTI是一種強力的蛋白酶抑制劑,可抑制多種酶的活性,能通過多種途徑阻滯炎癥反應及氧化應激的中間環(huán)節(jié),減少TNF-α等致炎因子及介質的釋放[14],抑制氧自由基的生成,降低血腦屏障通透性,減輕腦水腫,從而保護腦細胞[15-16]。我們在實驗2中觀察UTI對ROSC后不同時點大腦皮層、海馬內MDA、GSH含量的變化和對神經元凋亡的影響,結果表明UTI明顯減少ROSC后實驗動物大腦皮層及海馬內MDA含量、提高GSH含量。因此,我們認為UTI可顯著抑制兔ROSC后大腦皮層和海馬MDA水平,提高GSH含量,加強機體內抗氧化能力,維持氧化與抗氧化之間的平衡,保護大腦皮層及海馬神經元。
Nrf2是細胞內抗氧化應激的重要轉錄因子。在生理狀態(tài)下,Nrf2與KEAP1以二聚體的形式存在于細胞漿中[6]。在基礎條件下,絕大部分Nrf2以非活性狀態(tài)儲存于細胞質中,與 KEAP1相偶聯,后者與胞漿肌動蛋白結合而被錨定在胞漿,通過泛素介導的蛋白降解系統(tǒng)維持Nrf2的基礎水平;另一部分Nrf2以活性狀態(tài)存在于細胞核中介導基因的基本轉錄。泛素化的Nrf2很快被26S蛋白酶體降解,使Nrf2通路關閉,抑制26S蛋白酶可能使Nrf2在細胞核堆積,持續(xù)開放Nrf2通路[17]。26S蛋白酶是泛素化酶系統(tǒng)的重要成員,缺血再灌注后26S蛋白酶被激活,廣泛參與組織損傷,抑制其激活可減輕組織損傷,保護缺血性心肌損傷[18-20],UTI可能通過抑制26S蛋白酶,減少Nrf2降解,促進其轉入細胞核內。在實驗2中Western blotting結果顯示Nrf2蛋白表達在ROSC后2 h、4 h和8 h UTI組 Nrf2的胞核/胞漿比明顯高于model組,表明CPR后UTI可促進Nrf2轉入細胞核內與ARE相互作用,啟動下游的抗氧化蛋白、II相解毒酶、蛋白酶體和分子伴侶等基因轉錄和表達[21],發(fā)揮其抗氧化作用,保護全身組織器官免受缺血再灌注帶來的氧化損傷,減少神經元凋亡。
UTI已被廣泛應用于臨床,但在CPR后用于預防繼發(fā)性腦損傷的研究還比較少,我們的研究表明UTI可升高ROSC后兔腦組織GSH水平,降低MDA含量,增加Nrf2的表達,減少神經元的凋亡,為UTI用于預防CPR后繼發(fā)性腦損傷的治療提供了一定的理論基礎,其有效性還有待臨床研究來證實。
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