涂飛霞，阮 菲， 吳瑞瑾，詹 宏， 馬俊彥，林 俊

(浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310006)

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是一種常見的良性婦科疾病，多見于育齡期婦女，其引起的痛經(jīng)、盆腔疼痛、不孕等問題嚴重影響婦女的生活質(zhì)量和生育能力［1］。內(nèi)異癥雖然是一個良性疾病，但具有類似腫瘤的惡性生物學行為如增殖、侵襲及復發(fā)等［2－3］。Janus激酶/信號轉導與轉錄活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路與細胞分化、增殖、侵襲和凋亡密切相關，并受細胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)的負反饋調(diào)節(jié)。STAT3和 SOCS3是 STAT家族和SOCS家族的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中存在著STAT3的過度活化和SOCS3表達的減少或缺失［4］。內(nèi)異癥異位病灶的形成與腫瘤轉移非常相似，需要異位子宮內(nèi)膜細胞的黏附增殖、細胞外基質(zhì)的降解、新生血管生成以及抵抗機體免疫清除等過程。目前STAT3和SOCS3在內(nèi)異癥中的表達尚未見報道，我們分別檢測了內(nèi)異癥患者異位、在位子宮內(nèi)膜組織和非內(nèi)異癥患者子宮內(nèi)膜組織中STAT3、磷酸化STAT3和SOCS3在蛋白水平的表達情況，以揭示STAT3和SOCS3與內(nèi)異癥的相關性。

材料和方法

1 材料

1.1 標本 85例組織標本收集自2011年3～4月在浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院行手術治療的患者。30例異位子宮內(nèi)膜組織(異位組，n=30)取自行卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫剝除術患者，并經(jīng)病理確診為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，年齡(37.7±6.7)歲，根據(jù)r－AFS分期，Ⅰ/Ⅱ期有2例，Ⅲ/Ⅳ期28例。30例在位內(nèi)膜組織(卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜，在位組，n=30)取自內(nèi)異癥患者行子宮切除或刮宮術者，年齡(41.5±6.7)歲，疾病分期處于Ⅰ/Ⅱ期有4例，Ⅲ/Ⅳ期26例。25例對照子宮內(nèi)膜組織(對照組，n=25)取自因縱隔子宮、子宮肌瘤、伴有輸卵管疾病的不孕癥行腹腔鏡檢查及手術的患者，并經(jīng)腹腔鏡觀察未患子宮內(nèi)膜異位癥，年齡(40.8±6.5)歲。3組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，在位和對照子宮內(nèi)膜處于增殖期或分泌期依照病理檢查結果分期，異位內(nèi)膜所處月經(jīng)周期根據(jù)患者末次月經(jīng)時間以及血清雌孕激素水平判斷。所有入選者均無內(nèi)外科伴發(fā)疾病，有規(guī)律月經(jīng)周期(28～32 d)，手術前3個月內(nèi)未接受激素及其它藥物治療、未放置宮內(nèi)節(jié)育器。實驗經(jīng)本院倫理委員會審批通過，標本收集前均簽署本人知情同意書。組織標本經(jīng)冰PBS清洗后立即放入液氮中，于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 組織蛋白裂解液(成分:20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1%Triton X －100，sodium pyrophosphate，β － glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin，1 mmol/L PMSF)(碧云天)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國)，0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)(Pall Life Sciences)，ECL發(fā)光液(Biological Industries)，兔多克隆抗人SOCS3抗體、兔多克隆抗人STAT3抗體、兔多克隆抗人p－STAT3抗體(Tyr705)(Cell Signaling Technology)，鼠單克隆抗GAPDH抗體(Santa Cruz Technology)，辣根過氧化物酶標記的抗兔、抗鼠Ⅱ抗(Cell Signaling Technology)。

2 方法

Western blotting檢測STAT3、p－STAT3和SOCS3蛋白表達。取50 mg組織勻漿裂解提取蛋白質(zhì)，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取100 μg總蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離后轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗 SOCS3、p－STAT3、STAT3和鼠抗 GAPDHⅠ抗(分別稀釋 1∶1000、1∶1000、1∶2000、1∶2000)4 ℃孵育過夜，室溫孵育相應的抗兔、抗鼠Ⅱ抗(分別稀釋1∶4000，1∶5000)1 h，應用ECL發(fā)光液，在ImageQuant LAS 4000 mini下曝光顯影。用ImageQuantTL 7.0軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，比較3組SOCS3、STAT3分別與GADPH的灰度值比值，以及p－STAT3與STAT3灰度值比值評價STAT3活化程度。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 STAT3及其活化形式p－STAT3在3組內(nèi)膜組織中的表達

單因素方差分析顯示總STAT3蛋白的表達在3組中無顯著差異(P＞0.05)，而其活化形式Tyr705位點磷酸化的STAT3與總STAT3比值(p－STAT3/STAT3，即STAT3活化水平)呈現(xiàn)明顯差異(P＜0.01)。兩兩比較顯示異位組p－STAT3/STAT3與對照組(P＜0.01)和在位組(P＜0.01)的差異均有統(tǒng)計學意義，而在位組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1、圖1。對照組中分泌期STAT3磷酸化水平高于增殖期(t=－3.864，P＜0.01)，而在位組(t=－0.681，P＞0.05)和異位組(t= －0.024，P＞0.05)中則不隨月經(jīng)周期變化，見圖2。各組年齡在35歲及以上與年齡35歲以下者比較，p－STAT3/STAT3和總STAT3表達差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。異位組中痛經(jīng)患者與無痛經(jīng)患者p－STAT3/STAT3表達無顯著差異(P＞0.05)。

2 SOCS3蛋白在3組子宮內(nèi)膜組織中的表達

SOCS3蛋白在對照組中表達最高，在位組其次，異位組最低，見表1、圖1。3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，異位組與對照組(P＜0.01)和在位組(P＜0.01)比較差異均有統(tǒng)計學意義，對照組與在位組比較無明顯差異(P＞0.05)。各組SOCS3蛋白的表達與月經(jīng)周期無關(P＞0.05)，年齡大于等于35歲與小于35歲者SOCS3蛋白表達也無顯著差異(P＞0.05)。異位組中痛經(jīng)患者與無痛經(jīng)患者SOCS3表達比較無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.The activation level of STAT3 and the expression of SOCS3 protein in the three groups..*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs the eutopic group.圖1 STAT3磷酸化活化水平與SOCS3蛋白表達

Figure 2.The activation level of STAT3 in the proliferative and secretory phases of different groups..*P＜0.05 vs the corresponding proliferative phase.圖2 STAT3磷酸化活化水平與月經(jīng)周期的關系

3 STAT3磷酸化活化水平與SOCS3蛋白相關性分析

比較內(nèi)異癥患者在位和異位內(nèi)膜標本中SOCS3及STAT3磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)SOCS3表達與p－STAT3/STAT3比值呈負相關(r=－0.499，P＜0.01)。

討 論

STAT3廣泛表達于各種組織和細胞，磷酸化活化后形成二聚體從細胞質(zhì)進入細胞核，調(diào)控靶基因如細胞周期素D1(cyclin D1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、bcl－xL和 bcl－2等的表達，促進細胞生長、抵抗凋亡、血管生成及侵襲［5］。本研究結果顯示異位內(nèi)膜中STAT3的磷酸化活化水平明顯高于在位和對照內(nèi)膜，提示異位子宮內(nèi)膜存在STAT3的過度活化。內(nèi)異癥患者腹腔液中多種促炎性細胞因子如白細胞介素6(IL－6)、腫瘤壞死因子α(TNF－α)等分泌增多，而這些細胞因子是JAK/STAT3通路重要的激活因子，可能是引起異位子宮內(nèi)膜細胞STAT3過度活化的原因之一。STAT3參與調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的蛻膜化，對受孕起重要作用，Dimitriadis等［6］發(fā)現(xiàn)p－STAT3在分泌期的子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細胞表達明顯高于增殖期。在對照子宮內(nèi)膜，我們觀察到分泌期STAT3磷酸化水平明顯高于增殖期;而在內(nèi)異癥患者的在位和異位內(nèi)膜中，STAT3磷酸化水平不隨月經(jīng)周期變化，提示內(nèi)異癥患者STAT3的活化異?？赡芘c在位和異位子宮內(nèi)膜細胞蛻膜化分化能力異常［7］有一定的聯(lián)系，這些細胞因不能正常分化而表現(xiàn)出增殖能力增強，與異位病灶的形成和發(fā)展密切相關。

表1 各種蛋白在3組中的表達Table 1.Expression of different proteins in the three groups()

表1 各種蛋白在3組中的表達Table 1.Expression of different proteins in the three groups()

*P ＜0.05 vs the control group;△P＜0.05 vs the eutopic group;#P ＜0.05 vs the corresponding proliferative phase.

SOCS3(SOCS3/GAPDH)Total STAT3(STAT3/GAPDH)Activation of STAT3(p－STAT3/STAT3)Control(n=25)1.475 ±0.7890.749 ±0.408 0.541 ±0.243 0.919 ±0.601 Proliferative(n=14) 0.882 ±0.293 0.592 ±0.332 Secretory(n=11) 0.579 ±0.480 1.336 ±0.618#Eutopic(n=30) 0.623 ±0.220 0.678 ±0.271 0.979 ±0.416 Proliferative(n=19) 0.646 ±0.205 0.939 ±0.424 Secretory(n=11) 0.584 ±0.250 1.047 ±0.413 Ectopic(n=30) 0.263 ±0.156 ＊△ 0.684 ±0.317 1.471 ±0.738＊△Proliferative(n=18) 0.297 ±0.177 1.468 ±0.725 Secretory(n=12)0.211 ±0.103

SOCS3基因被描述為一種潛在的腫瘤抑制基因，它通過對JAK/STAT、局部黏著斑激酶(FAK)及促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)等途徑的負性調(diào)控而發(fā)揮抗腫瘤細胞生長、遷移等作用［4，8］。SOCS3基因啟動子含有 STAT3結合位點，受活化的STAT3誘導表達，并反饋抑制STAT3的活性。本研究發(fā)現(xiàn)在異位內(nèi)膜中SOCS3蛋白表達明顯低于對照和在位內(nèi)膜，異位內(nèi)膜中過度活化的STAT3并沒有誘導SOCS3表達相應的上升，提示在內(nèi)異癥中可能存在某些因素導致SOCS3蛋白下調(diào)，使其對多種信號的負反饋調(diào)節(jié)功能減弱，包括STAT3。在異位子宮內(nèi)膜細胞，受促炎癥細胞因子激活的STAT3由于缺乏SOCS3的負反饋調(diào)節(jié)而處于持續(xù)過度活化狀態(tài)，進而引起細胞增殖和侵襲能力增強，故我們推測兩者的共同作用可能參與內(nèi)異癥的發(fā)病。在正常子宮內(nèi)膜細胞中，SOCS3對JAK/STAT等通路的負反饋處于平衡狀態(tài)，協(xié)調(diào)細胞的多種生物學行為。而在內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜，其SOCS3蛋白表達與對照內(nèi)膜無差異，可能是內(nèi)膜細胞逆流入腹腔后，在腹腔內(nèi)環(huán)境的作用下出現(xiàn)多種信號通路活化異常、基因表達異常等，導致SOCS3蛋白表達下降，并進一步參與異位病灶的形成和發(fā)展。至于SOCS3表達異常的原因以及參與調(diào)控的信號機制都需要進一步深入探討。

本次研究首次證實在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位子宮內(nèi)膜組織中，存在STAT3的過度活化和SOCS3蛋白表達的下調(diào)，為我們探討內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展的機制提供了新思路，下一步我們將從細胞分子水平研究STAT3活化及SOCS3下調(diào)的機制，為內(nèi)異癥的治療及新藥研發(fā)提供一種新的策略。

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