王 琛，李玉珍，王曉礽，呂振嶸，史大卓△，劉秀華△

(1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091;2解放軍總醫(yī)院病理生理研究室，北京 100853)

上世紀(jì)九十年代以來(lái)我國(guó)對(duì)西洋參莖葉化學(xué)成分和藥理學(xué)作用進(jìn)行了大量研究，表明其化學(xué)成分包括皂苷類(lèi)、氨基酸類(lèi)、糖類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、無(wú)機(jī)元素類(lèi)和脂肪酸類(lèi)等，西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin，PQS)是從西洋參莖葉中提取出的活性成分。研究顯示，PQS具有抗缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)心肌細(xì)胞凋亡、抗心律失常、改善梗死后心室重構(gòu)、增強(qiáng)抗氧化酶活性、減輕缺血所致的游離脂肪酸代謝紊亂和乳酸堆積、維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)等作用［1-4］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和貯存Ca2+的主要場(chǎng)所，缺血缺氧、葡萄糖/營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭、大量自由基的產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等均可引起ER功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 (endoplasmic reticulum stress，ERS)。持續(xù)而嚴(yán)重的ERS可通過(guò)鈣超載、影響線粒體功能等加重細(xì)胞凋亡和I/R損傷［5-6］，表現(xiàn)為ERS標(biāo)志分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白 (calreticulin，CRT)的表達(dá)及ERS相關(guān)細(xì)胞凋亡途徑［C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、caspase-12等］的激活。PQS是否通過(guò)抑制過(guò)度的ERS，發(fā)揮抗心肌I/R損傷的作用，以往尚缺乏研究。本研究利用乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧 (hypoxia/reoxygenation，H/R)模型，觀察PQS對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并通過(guò)ERS探討PQS抗心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物與試劑

清潔級(jí)SD 24 h內(nèi)新生乳鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;PQS粉由吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司提供;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco;新生牛血清 (newborn calf serum，NCS)購(gòu)自PAA;胰蛋白酶(trypsin)購(gòu)自Amresco;蛋白酶抑制劑購(gòu)自Sigma;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物工程公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydogenase，LDH)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TRNzol-A+總RNA提取試劑、2×Taq PCR Master Mix和電泳級(jí)瓊脂糖購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;cDNA第1鏈合成試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成;蛋白電泳分子量 (7～175 kD)標(biāo)記為Bio-Rad產(chǎn)品;兔抗人CRT、caspase-12和GRP78多克隆抗體購(gòu)自Stressgen;兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人CHOP單克隆抗體和兔抗人Bax、Bcl-2多克隆抗體均購(gòu)自Cell Signal;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自Millipore;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz。

2 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

參照Simpson等［7］加以改進(jìn)，無(wú)菌操作取出生后24 h內(nèi)SD新生乳鼠心尖部組織，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入適量0.15% 胰蛋白酶，37℃水浴下輕柔攪動(dòng)、反復(fù)消化，制備心肌細(xì)胞懸液，差速貼壁。用含15%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每瓶3×106，接種于底面積為75 cm2的培養(yǎng)瓶，置CO2孵箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。

3 實(shí)驗(yàn)分組

取原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，置于CO2孵箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，換無(wú)新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液同步化24 h后，進(jìn)行如下2個(gè)部分研究。為證明PQS對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用分為以下3組:正常對(duì)照 (control)組:細(xì)胞置CO2孵箱37℃，常規(guī)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;H/R組:按Li等［8］將細(xì)胞置于缺氧倉(cāng)內(nèi)，通入95%N2-5%CO2混合氣，缺氧4 h后放回CO2孵箱，37℃常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)12 h結(jié)束實(shí)驗(yàn);PQS+H/R組:以PBS緩沖液稀釋PQS原粉，配成濃度分別為20、40、80、160 g/L的儲(chǔ)存液，過(guò)濾除菌，4 ℃保存，應(yīng)用時(shí)將儲(chǔ)存液1000倍稀釋加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行H/R操作，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)圖1)，選取終濃度為160 mg/L為最佳給藥濃度。為進(jìn)一步探討PQS對(duì)H/R心肌細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制，又分為以下4組:正常對(duì)照組、H/R組和H/R+PQS組，處理同上;PQS組，細(xì)胞置CO2孵箱37℃常規(guī)培養(yǎng)16 h，然后加入160 mg/L的PQS水溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

4 凋亡率、LDH漏出及細(xì)胞存活率測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液制備單細(xì)胞懸液，按照測(cè)試盒方法分別加入染料Annexin V和溴化丙啶(propidium lodide，PI)，室溫下孵育5 ～15 min，以流式細(xì)胞儀(BD FACScalibur，Becton-Dickinson)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)［9］測(cè)定細(xì)胞存活率，按LDH測(cè)試盒方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性。

5 RT－PCR測(cè)定

TRNzol-A+提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量。按cDNA第1鏈合成試劑盒操作步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。各目的基因上、下游引物見(jiàn)表1。采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析條帶平均吸光度值 (A)，以目的片段和GAPDH的平均光密度比值反映目的基因mRNA水平。

Figure 1.Panax quinquefolium saponin(PQS)reduced apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation(H/R)in vitro as determined by flow cytometric analysis of Annexin V and propidium iodide(PI)double-stained cardiomyocytes.A:flow cytometric images;B:apoptotic rates of cardiomyocytes in different groups..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析PQS對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

表1 PCR反應(yīng)中目的片段引物Table 1.Primer sequences used in PCR

6 Western blotting分析

按Liu等［10］報(bào)道方法提取心肌細(xì)胞總蛋白，Bradford法蛋白定量后分裝，-80℃保存。取上述細(xì)胞蛋白提取液上清(含蛋白80 μg)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE，12%分離膠)，將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%BSA封閉40 min后分別加入 CRT、GRP78、caspase-12、Bcl-2、Bax多克隆抗體(均為1∶500)、CHOP 單克隆抗體 (1∶500)4℃過(guò)夜孵育，用1×TBS-T洗膜后，以相應(yīng)的II抗孵育1.5 h，并以GAPDH(1∶500)單克隆抗體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程，作為上樣對(duì)照?；瘜W(xué)發(fā)光ECL顯示，采用Image-Pro Plus 4.1軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值(integrated A value，IA，平均吸光度值×面積)，以靶蛋白/GAPDH IA比值反映靶蛋白水平。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)進(jìn)行多組間比較，采用q檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較，兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 西洋參莖葉總皂苷對(duì)H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

1.1 心肌細(xì)胞凋亡率 正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞凋亡率為2.12%;H/R組細(xì)胞凋亡率為7.09%(P ＜0.05);分別以 20、40、80、160 mg/L PQS培養(yǎng)細(xì)胞24 h，細(xì)胞凋亡率分別為4.2%、3.5%、3.2%和2.9%，P＜0.05，呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性 正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性為113.4 U/L，H/R組細(xì)胞膜通透性增高，培養(yǎng)液LDH活性較對(duì)照組升高約6倍 (P＜0.05)，以160 mg/L PQS培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，其細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性較H/R心肌細(xì)胞培養(yǎng)液降低了66.58%(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

1.3 細(xì)胞存活率 臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞存活率為96.3%，H/R組細(xì)胞存活率較對(duì)照組降低21.7%(P＜0.05)。以160 mg/L PQS培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24 h，其細(xì)胞存活率較H/R心肌細(xì)胞升高了21.1%(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

1.4 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá) RT-PCR的結(jié)果顯示，H/R組Bcl-2 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組降低44.5%(P＜0.05)，BaxmRNA的表達(dá)較對(duì)照組升高86.9%(P＜0.05)，提示H/R可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax mRNA的表達(dá)。PQS可誘導(dǎo)H/R后抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表達(dá)，PQS+H/R組心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)較H/R組升高30.9%(P＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax mRNA的表達(dá)，Bax mRNA表達(dá)較H/R組降低39.7%(P＜0.05)，見(jiàn)圖2A、B。

表2 PQS預(yù)處理對(duì)H/R后細(xì)胞存活率及LDH活性的影響Table 2.Effect of PQS preconditioning on survival rates and LDH activity of cardiomyocytes after H/R(.n=4)

表2 PQS預(yù)處理對(duì)H/R后細(xì)胞存活率及LDH活性的影響Table 2.Effect of PQS preconditioning on survival rates and LDH activity of cardiomyocytes after H/R(.n=4)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.H/R:hypoxia/reoxygenation;PQS:Panax quinquelium saponin.

Group Cell survival rate(%) LDH activity(U/L)Control 96.29±0.79 113.40±11.87 H/R 75.36±2.32* 671.33±46.62*160 mg/L PQS+H/R 95.47±0.53# 224.33±22.57*#

Western blotting的結(jié)果顯示，H/R組Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低58.3%(P＜0.05)，Bax蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高167.0%(P＜0.05)，提示H/R可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2和抑制促凋亡蛋白Bax蛋白表達(dá)。PQS可誘導(dǎo)H/R后抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，PQS+H/R組心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)較H/R組升高48.0%(P＜0.05);抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，較H/R組降低48.4%(P＜0.05)，見(jiàn)圖2C、D。

Figure 2.Panax quinquefolium saponin(PQS)reduced the expression of pro-apoptotic protein Bax and increased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 in H/R-treated cardiomyocytes.A:the levels of Bcl-2 and Bax mRNA were examined by RT-PCR.GAPDH was used as a normalization control.B:bar chart of densitometry of the bands shown in A.C:the levels of Bcl-2 and Bax protein were examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.D:bar chart of densitometry of the bands shown in C..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖2 PQS對(duì)H/R心肌細(xì)胞Bcl－2和Bax表達(dá)的影響

2 西洋參莖葉總皂苷對(duì)H/R心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的影響

2.1 GRP78、CRT mRNA和蛋白表達(dá)的變化 RTPCR的結(jié)果顯示，H/R可明顯誘導(dǎo)GRP78和CRT mRNA的表達(dá)，較對(duì)照組分別高380.0%和96.0%(P＜0.05);PQS可抑制H/R誘導(dǎo)的GRP78和CRT mRNA的表達(dá)，PQS+H/R組較H/R組分別降低61.6%和35.7%(P＜0.05)。Western blotting的結(jié)果顯示，H/R可明顯誘導(dǎo)GRP78和CRT蛋白的表達(dá)，較對(duì)照組分別升高142.0%和312.0%(P＜0.05);PQS可抑制H/R誘導(dǎo)的GRP78和CRT蛋白表達(dá)，較H/R組分別降低37.7%和52.2%(P＜0.05)，見(jiàn)圖 3。

2.2 CHOP mRNA和蛋白表達(dá)的變化 RT-PCR的結(jié)果顯示，H/R可明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞CHOP mRNA的表達(dá)，較對(duì)照組高311.0%(P＜0.05);PQS可抑制H/R后的CHOP mRNA表達(dá)，PQS+H/R組心肌細(xì)胞CHOP mRNA表達(dá)較H/R心肌細(xì)胞降低57.0%(P＜0.05);Western blotting結(jié)果顯示，H/R可明顯誘導(dǎo)CHOP蛋白表達(dá)，較對(duì)照組升高219.0%(P＜0.05);PQS抑制H/R后的CHOP蛋白的表達(dá)，PQS+H/R組心肌細(xì)胞CHOP蛋白表達(dá)較H/R組降低51.7%(P ＜0.05)，見(jiàn)圖4A、B。

Figure 3.Effect of Panax quinquefolium saponin(PQS)on the expression of GRP78 and CRT in H/R-treated cardiomyocytes.A:the levels of GRP78 and CRT mRNA were examined by RT-PCR.GAPDH was used as a normalization control.B:bar chart of densitometry of the bands shown in A.C:the levels of GRP78 and CRT protein were examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.D:bar chart of densitometry of the bands shown in C..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖3 PQS對(duì)H/R心肌細(xì)胞GRP78、CRT表達(dá)的影響

2.3 Capase-12蛋白表達(dá)的變化 采用可同時(shí)識(shí)別caspase-12酶原(pro-caspase-12，分子量約48～50 kD)和剪切后的caspase-12(cleaved caspase-12，分子量36 kD)的特異性抗體，進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示H/R可明顯誘導(dǎo)caspase-12蛋白剪切活化，較對(duì)照組升高180.0%(P＜0.05);PQS抑制H/R后caspase-12蛋白活化，以160 mg/L PQS培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，剪切后caspase-12蛋白表達(dá)較H/R心肌細(xì)胞降低34.9%(P ＜0.05)，見(jiàn)圖4C、D。

3 CHOP蛋白表達(dá)與凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl－2、Bax蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，ERS凋亡分子CHOP蛋白表達(dá)與促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)顯著正相關(guān) (r=0.956，P＜0.05)，與抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)顯著負(fù)相關(guān) (r=-0.967，P＜0.05)。

討 論

缺血再灌注 (ischemia/reperfusion，I/R)損傷指缺血一定時(shí)間的心肌恢復(fù)灌流后，組織損傷反而進(jìn)行性加重，心肌細(xì)胞從可逆損傷轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡鎿p傷的現(xiàn)象。心肌細(xì)胞壞死和凋亡是心肌I/R損傷的特征之一［11］。Musat-Marcu 等［12］在離體灌流大鼠心臟上發(fā)現(xiàn)，再灌注早期即可發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡。其中抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax參與了心肌I/R損傷中細(xì)胞凋亡的調(diào)控［13］。本研究利用乳鼠心肌細(xì)胞H/R模型，采用LDH活性檢測(cè)法、臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)以及RT-PCR和Western blotting方法，證實(shí)PQS能明顯減輕H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡。H/R前以160 mg/L PQS培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，與H/R心肌細(xì)胞相比，細(xì)胞凋亡率、LDH活性以及促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯降低，而細(xì)胞存活率及抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高。

Figure 4.Effect of Panax quinquefolium saponin(PQS)on the expression of the ERS-associated apoptotic protein CHOP and activation of the apoptotic effector enzyme caspase-12 in H/R-induced cardiomyocytes.A:the levels of CHOP mRNA and protein were examined by RT-PCR and Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.B:bar chart of densitometry of the bands shown in A.C:Western blotting analysis of caspase-12 activation in cardiomyocytes.GAPDH was used as a normalization control.D:bar chart of densitometry of the bands shown in C..n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R.圖4 PQS對(duì)H/R心肌細(xì)胞后CHOP表達(dá)的影響

I/R發(fā)生的主要環(huán)節(jié)是氧自由基產(chǎn)生和鈣超載，其機(jī)制尚未完全闡明，ER是調(diào)節(jié)Ca2+和蛋白質(zhì)合成的重要場(chǎng)所，因此ER理化環(huán)境改變和ER過(guò)負(fù)荷等因素導(dǎo)致的ERS在I/R損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義［14-15］。ERS是細(xì)胞對(duì)刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，一定程度的ERS誘導(dǎo)GRP78、CRT等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子表達(dá)上調(diào)［16］，增強(qiáng) ER處理未折疊蛋白的能力，促進(jìn)ER功能恢復(fù)。但H/R觸發(fā)的嚴(yán)重ERS可顯著增加GRP78和 CRT的蛋白表達(dá)［17-18］，誘導(dǎo) CHOP、caspase-12等促凋亡因子的表達(dá)及活化，觸發(fā)ERS相關(guān)凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和組織損傷［19-20］。本研究發(fā)現(xiàn)H/R前以160 mg/L的PQS培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h，可顯著抑制H/R誘導(dǎo)的GRP78、CRT mRNA和蛋白表達(dá)，提示PQS可能通過(guò)減輕H/R誘導(dǎo)的嚴(yán)重ERS觸發(fā)的細(xì)胞凋亡，起到心肌保護(hù)作用;CHOP通過(guò)直接調(diào)節(jié)核內(nèi)靶基因，增加細(xì)胞對(duì)ERS介導(dǎo)凋亡的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［21］。CHOP介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路與線粒體凋亡途徑有密切聯(lián)系，CHOP可通過(guò)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致Bax從胞漿內(nèi)向線粒體內(nèi)易位［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R前以160 mg/L的PQS培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞24 h，可顯著抑制H/R誘導(dǎo)的 CHOP mRNA和蛋白表達(dá);在此基礎(chǔ)上對(duì)CHOP蛋白表達(dá)與凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)之間進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CHOP蛋白表達(dá)與Bax蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示CHOP介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路可能通過(guò)抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致［23-24］，由此推測(cè)PQS可能通過(guò)抑制過(guò)度ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起到心肌保護(hù)作用;caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的組成性蛋白，以無(wú)活性酶原形式存在于ER膜胞漿側(cè)，在ERS時(shí)被剪切激活，cleaved caspase-12通過(guò)激活caspase-9、caspase-3 引起細(xì)胞凋亡［25］，因而caspase-12被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞cleaved caspase-12蛋白表達(dá)并引起細(xì)胞凋亡，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致［26］。H/R前以160 mg/L PQS培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，可顯著抑制H/R誘導(dǎo)的cleaved caspase-12的蛋白表達(dá)，提示PQS可能通過(guò)抑制caspase-12介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，我們認(rèn)為PQS通過(guò)抑制過(guò)度ERS發(fā)揮抗心肌細(xì)胞H/R損傷作用，表現(xiàn)為降低H/R誘導(dǎo)的 GRP78、CRT mRNA和蛋白表達(dá)，抑制 CHOP、caspase-12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路激活。但PQS對(duì)在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的心肌保護(hù)作用尚待進(jìn)一步研究。

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