肖 琴 陳 芳 常明泉 王 剛

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000

固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid dnanopartcles，SLN）系指以生理相容性的高熔點脂質(zhì)為骨架材料制備而成的納米粒。該制劑具有細(xì)胞親和性、靶向性、緩釋性、低毒性和穩(wěn)定性的特點，制成脂質(zhì)體的藥物其生物利用度可獲得大幅度提高[1-3]。槲皮素固體脂質(zhì)納米粒是一種以山崳酸甘油酯、膽固醇、大豆卵磷脂為載體材料，以丙酮-三氯甲烷（1∶1）為混合溶劑，以槲皮素為主藥，吐溫-80為乳化劑，采用熔融-勻化法制備而成的一種抗癌制劑，該制劑主要通過槲皮素對細(xì)胞的增殖作用及對血管的新生作用而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制和預(yù)防作用，從而達到抗癌目的[4-5]?？疾熘|(zhì)體的體外釋放度對優(yōu)化處方結(jié)構(gòu)、篩選制備工藝及合理用藥具有指導(dǎo)意義。本實驗擬用透析袋-高效液相色譜法對槲皮素固體脂質(zhì)納米粒的體外釋放度進行考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RCZ-1A型溶出試驗儀（上海黃海藥檢儀器廠，220 V，50 Hz）；戴安3000型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；分析天平（精度0.000 1 g）；透析袋（上海源葉生物科技公司，MWCO 7000，22 mm×1 m）；TGL-16G 離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UPS-200H 型超聲波震蕩儀（500 W，50 Hz，南京熊貓電子儀器有限公司）；LG-冰箱（LTR-B2071GTBC）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100081-200406）；生理鹽水（安徽豐原淮海制藥有限公司，批號：20111011）；槲皮素固體脂質(zhì)納米粒（太和醫(yī)院自制，批號：20120323）；甲醇為色譜純；無水乙醇、乙酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性[6]

色譜柱：迪馬 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品20.0 mg，置100 mL容量瓶中，先加無水乙醇約50 mL超聲震蕩溶解，再加無水乙醇至刻度，搖勻，即得200 μg/mL對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品1 g，置適宜燒杯中，加入無水乙醇約15 mL超聲震蕩，直至破乳分散均勻后將溶液轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，用無水乙醇分3次洗滌燒杯，每次10 mL，洗液并入量瓶中，定容，搖勻，取溶液適量，在離心機中離心15 min，轉(zhuǎn)速1.0×104r/min，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液即得（該溶液在 5～10℃的冰箱中保存）。

2.2.3 空白溶液的制備 精密稱取不含槲皮素的固體脂質(zhì)納米粒樣品1 g，按上述供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.3 干擾試驗

分別取“2.2”項下的各溶液，參照“2.1”項下色譜條件將溶液各進樣20 μL，記錄色譜圖，結(jié)果對照品溶液、供試品溶液在相同時間內(nèi)有同樣色譜峰出現(xiàn)，空白溶液無色譜峰出現(xiàn)，說明該脂質(zhì)體中的其他成分對主藥含量測定無干擾。見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項下的槲皮素對照品溶液（200 μg/mL）1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 及 10.0 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度， 即得 20.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0 μg/mL的各溶液，各溶液按照“2.1”項下色譜條件分別進樣3次，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得曲線方程為 A=1.343 5C-1.490 4（r=0.999 6），提示槲皮素在 20.0～200.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取“2.2”項下的對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣6次，記錄峰面積，計算平均值，RSD為0.79%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2”項下的對照品溶液，在冰箱中保存（5～10℃），于0、4、12、24、36、48 h 分別取樣，按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算平均含量為198.8 μg/g，RSD為1.38%。提示槲皮素溶液在低溫條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品6份，每份1 g，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，測得槲皮素平均含量為 100.9 μg/g，RSD=1.29%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已測知含量的樣品（批號：20120323）6份，各0.5 g，分別加入濃度為 80 μg/mL 對照品溶液 1 mL，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算槲皮素回收率，結(jié)果見表1。

2.9 體外釋放度考察[7-8]

精密稱取槲皮素固體脂質(zhì)納米粒10 g，置直徑為22 mm、長約10 cm的透析袋中，除去袋內(nèi)空氣，兩頭用線繩扎緊，盤繞固定于溶出儀攪拌槳上，將攪拌槳置于距溶出杯底約1.5 cm處，以生理鹽水500 mL為釋放介質(zhì)，保持溫度（37.0±0.5）℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速至 50 r/min，分別 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0 h定時取樣2 mL（同時補加同體積的釋放介質(zhì)），用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按照“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算出各時間槲皮素的累計釋放百分率，以釋放率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，用Excel擬合釋放曲線，結(jié)果見圖2。

表1 槲皮素固體脂質(zhì)納米粒加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

圖2 槲皮素固體脂質(zhì)納米粒體外累積釋放度曲線

結(jié)果槲皮素固體脂質(zhì)納米粒中的槲皮素在48 h時累積釋放率為95.6%，具有顯著的緩釋特性。

3 討論

SLN的制備主要有熔融-勻化法、冷卻-勻化法、納米乳化法及薄膜超聲法。根據(jù)各藥物的性質(zhì)及臨床用途選用適宜方法，藥物制成SLN后具有物理穩(wěn)定性高、藥物泄露少、緩釋性好、低毒性、易于規(guī)模生產(chǎn)的特點。槲皮素固體脂質(zhì)納米粒系采用熔融-勻化法制備而成。該制劑以山崳酸甘油酯、膽固醇、大豆卵磷脂為載體材料，上述3種包材均為疏水性載體材料，這些材料在乳化冷卻過程中形成網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)，槲皮素溶液以分子狀態(tài)分散于骨架內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)，在模擬人體溫度和適度運動狀態(tài)條件下（50 r/min）脂質(zhì)體被軟化，藥物的釋出必須首先通過載體材料的網(wǎng)狀骨架擴散，從而形成緩釋效應(yīng)[9]。

流動相以甲醇-4.3%乙酸溶液（55∶45）組成，含量測定時洗脫分離效果好[10]。槲皮素的分子量為338.27，在選用透析袋時，考慮到脂質(zhì)體的基質(zhì)具有一定的黏度，可能對藥物向外釋放產(chǎn)生阻滯作用，故選用截留分子量較大的CE透析袋（MWCO 7000），以使在透析過程中藥物能夠充分釋出。

實驗結(jié)果顯示，槲皮素固體脂質(zhì)納米粒中的槲皮素48 h內(nèi)累積釋放率為95.6%，說明該脂質(zhì)體具有良好的緩釋特性。應(yīng)用透析袋-高效液相色譜法考察槲皮素固體脂質(zhì)納米粒的體外釋放度操作便利，方法穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)性好。

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