張淑芹 梁重陽(yáng) 劉志屹 戴 璐 張福明 孫 非 (吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，長(zhǎng)春130021)

真菌靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(LZ-8)是1989年Kino等人從赤靈芝子實(shí)體中分離提取出的第一種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，是由110個(gè)氨基酸組成，分子量12.4 kD，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。本課題組將LZ-8的重組基因轉(zhuǎn)移到酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得了重組表達(dá)，制備出重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)［1，2］，并進(jìn)行相關(guān)的藥效學(xué)研究。由于rLZ-8的單克隆抗體的制備至今未見報(bào)道，本文擬應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備鼠抗rLZ-8的單克隆抗體，為rLZ-8藥效學(xué)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白(rLZ-8)，本室提供;DMDM 細(xì)胞培養(yǎng)液、HAT(次黃嘌呤、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷)，Gibco公司，美國(guó);羊抗兔辣根過氧化物IgG(IgG-HRP)、弗氏完全佐劑(CFA)、弗式不完全佐劑、PEG4000、OPD(鄰苯二胺)、抗體亞類鑒定試劑盒，Sigma公司，美國(guó);牛血清白蛋白(BSA)，Roche公司，美國(guó)。

1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀，TECAN;低溫冰箱，NBS，美國(guó);紫外可見分光光度計(jì)，尤尼克斯;島津高效液相色譜儀，日本;AKTA蛋白質(zhì)純化儀，GE，美國(guó);凝膠成像儀，天能科學(xué)儀器有限公司;電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)胞株及動(dòng)物 SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所提供;免疫用BALB/c小鼠，中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供。

1.4 BALB/c小鼠的免疫 小鼠免疫按常規(guī)方法進(jìn)行［3］，初次免疫用 rLZ-8(100μg)的 PBS稀釋液與等體積的免疫用完全弗氏佐劑的混合物后腹腔注射免疫BALB/c雌性小鼠;第2～4次免疫以不完全弗氏佐劑乳化的rLZ-8(50μg)為免疫原，第5次用rLZ-8(50μg)作為免疫原。從第3次免疫開始，每次免疫后7天采血，ELISA法和Western blot法測(cè)定血清抗體的效價(jià)和特異性。

1.5 雜交瘤細(xì)胞的融合 細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行［4］，在追加免疫后的第3天，選擇一只效價(jià)最高的小鼠取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，用50%的PEG4000作為融合劑，然后將融合細(xì)胞置于HAT培養(yǎng)液中進(jìn)行選擇培養(yǎng)。每天觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積1/10以上時(shí)吸出上清檢測(cè)抗體。

1.6 雜交瘤細(xì)胞的篩選 待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積1/10以上時(shí)，用rLZ-8(1μg/ml)包被 ELISA板，用ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆孔。同時(shí)設(shè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞上清液作為陰性對(duì)照。OD值大于或等于陰性孔的2.1倍即為陽(yáng)性孔，當(dāng)陽(yáng)性孔數(shù)量較多時(shí)，可選取其中部分OD值相對(duì)較高的孔做克隆化。

1.8.4 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定 將雜交瘤細(xì)胞制備的小鼠腹水以及細(xì)胞上清液用PBS緩沖液以1∶1 000開始稀釋，以同等稀釋度的注射SP2/0細(xì)胞的小鼠腹水以及細(xì)胞上清液作為陰性對(duì)照，采用間接ELISA方法進(jìn)行大范圍的初步篩選。然后根據(jù)單抗的效價(jià)范圍進(jìn)行細(xì)致稀釋后繼續(xù)采用間接ELISA方法在波長(zhǎng)492 nm處測(cè)定OD值。陽(yáng)性樣品OD值大于或等于2.1倍陰性樣品OD值的最高稀釋倍數(shù)為該單抗的效價(jià)。

2.2 rLZ-8純品的液相色譜圖 rLZ-8純品的液相色譜如圖2所示，該蛋白在流速1 ml/min時(shí)的保留時(shí)間是7.622分鐘，與圖1對(duì)比。其分子量為12.4 kD，純度在95%以上，符合制備單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 腹水制備、純化及效價(jià)測(cè)定

1.8.1 腹水的制備 按常規(guī)方法將雜交瘤細(xì)胞數(shù)調(diào)至1×106～2 ×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，向弗氏不完全佐劑致敏的小鼠腹腔注射0.5 ml/只。同時(shí)用SP2/0細(xì)胞制備陰性腹水，7～14天后收獲腹水。用無(wú)菌離心管離心取上清分裝后，于-80℃冰箱保存。

果不其然，一家人辛辛苦苦奮斗了好幾年之后，不僅欠債還完了，小佳還考上了一所國(guó)內(nèi)頂尖的政法大學(xué)。旁人都說(shuō)他們家人有福氣，千金散盡還復(fù)來(lái)，但我很清楚，他們的福氣都是在餐桌上一點(diǎn)一點(diǎn)修來(lái)的。

1.8.3 單克隆抗體亞類的鑒定 采用Sigma公司的免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒對(duì)本次制備的單克隆抗體亞類進(jìn)行鑒定，方法為間接ELISA方法，包被抗原為純化的rLZ-8，濃度為1 mg/ml，實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

近年來(lái)，我們不斷完善預(yù)算績(jī)效管理機(jī)制，績(jī)效評(píng)價(jià)工作穩(wěn)步推進(jìn)并不斷“擴(kuò)面、增量”，實(shí)現(xiàn)了所有部門預(yù)算單位整體支出和上級(jí)專項(xiàng)資金績(jī)效自評(píng)全覆蓋，具體情況如下：

統(tǒng)一存儲(chǔ)和分布式存儲(chǔ)是實(shí)現(xiàn)大數(shù)據(jù)平臺(tái)的基礎(chǔ) 把先前分散存放在各個(gè)服務(wù)器上的數(shù)據(jù)統(tǒng)一存放在磁盤陣列上，實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一存儲(chǔ)。磁盤陣列通過器件冗余、RAID重構(gòu)、硬盤壞道檢測(cè)修復(fù)和快照等技術(shù)，保障數(shù)據(jù)的安全。同時(shí)，統(tǒng)一存儲(chǔ)也可以配置備份存儲(chǔ)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定期增量備份或者異地災(zāi)備。由于實(shí)施了統(tǒng)一存儲(chǔ)，各個(gè)應(yīng)用所需要的磁盤空間可以“統(tǒng)籌規(guī)劃，按需分配”，徹底解決單臺(tái)服務(wù)器磁盤空間不足或者過剩的問題。智慧校園將使用統(tǒng)一存儲(chǔ)，為SAN、NAS和iSCSI提供多層存儲(chǔ)。統(tǒng)一存儲(chǔ)支持基于塊訪問協(xié)議（如FCP和iSCSI）和基于文件訪問協(xié)議（如CIFS和NFS），并使用相同的管理工具和管理界面。

1.8.5 單克隆抗體特異性檢測(cè) 用Western blot膠片曝光方法對(duì)rLZ-8單克隆抗體特異性進(jìn)行分析。首先將rLZ-8進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將其電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，再將膜轉(zhuǎn)移至封閉液中，清洗后將制備的單克隆抗體作為一抗、羊抗鼠IgG-HRP作為二抗進(jìn)行反應(yīng)，最后經(jīng)顯影定影后觀察結(jié)果。

2.1 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜 圖1是蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在流速1 ml/min時(shí)液相色譜圖，每一個(gè)出峰時(shí)間對(duì)應(yīng)一種分子量的蛋白，用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量。

2 結(jié)果

合約規(guī)劃是目標(biāo)成本實(shí)現(xiàn)的第一步。在建設(shè)工程項(xiàng)目確定目標(biāo)成本后，就需要按照分解的目標(biāo)成本進(jìn)行合約規(guī)劃。合約規(guī)劃不能簡(jiǎn)單地理解為只服務(wù)于成本管理，其還應(yīng)服務(wù)于整個(gè)項(xiàng)目管理，即服務(wù)于招標(biāo)、采購(gòu)、施工、銷售及運(yùn)維等。合約的規(guī)劃要綜合考慮以下因素。

1.8.2 腹水的純化 采用AKTA純化系統(tǒng)，Protein A Sepharose親和層析柱對(duì)腹水進(jìn)行純化。將層析柱垂直固定在AKTA純化系統(tǒng)上，將適量的Protein A Sepharose裝入柱中，并將管路接好，以50 cm/h的速率裝柱，待柱體完全沉降壓實(shí)后，繼續(xù)用5～10倍體積的20 mmol/L pH7.0磷酸鈉鹽緩沖液以2 ml/min的速度洗滌柱床至基線平衡為止;將收集的腹水上清液對(duì)20 mmol/L pH7.0磷酸鈉鹽緩沖液透析，以獲得適當(dāng)?shù)膒H和離子強(qiáng)度，然后將樣品通過上樣環(huán)加入親和柱后，將流速調(diào)至0.4 ml/min，繼續(xù)用20 mmol/L pH7.0磷酸鈉鹽緩沖液平衡;然后用20 mmol/L pH4.0檸檬酸鈉鹽緩沖液洗脫結(jié)合在柱子上的抗體;并設(shè)定峰收集樣品，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 雜交瘤細(xì)胞的克隆化 用有限稀釋法制備雜交瘤細(xì)胞懸液，分別加入已鋪好飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，適時(shí)用倒置顯微鏡觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，選擇只有一個(gè)集落生長(zhǎng)的孔進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并傳2～4代后及時(shí)凍存。一般經(jīng)過2～3次克隆化操作，就可以獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

劉興濤[17]用半荷楓等10多種藥材配制的藥酒，治療軟組織損傷1560例，結(jié)果1250例效果優(yōu)異，293例良好，17例較差。表現(xiàn)出較好的治療軟組織損傷效果，極少出現(xiàn)皮膚癢疹副作用，但停藥后外涂膚輕松軟膏即愈。

2.3 單克隆抗體的制備結(jié)果 采用小鼠腹腔注射的方法制備腹水，經(jīng)過純化后對(duì)抗體進(jìn)行液相色譜分析，如圖3所示，該抗體在流速1 ml/min時(shí)的保留時(shí)間是5.760分鐘，與圖1對(duì)比，其分子量約為200 kD左右。

七八個(gè)鬼子避開和吳參謀一伙糾纏，一邊追趕一邊打槍，缺一指拉著孔老一拼命往前跑，正跑著背后一顛，就直直往前撲去，孔老一翻轉(zhuǎn)過缺一指時(shí)，見他胸口的血像噴泉一樣噴了他一臉。

2.4 單克隆抗體的亞型鑒別 從表1中ELISA結(jié)果可以看出，細(xì)胞株clone13-2-3與IgG1亞型的二抗反應(yīng)呈陽(yáng)性，clone11-4-4與IgG2a亞型的二抗反應(yīng)呈陽(yáng)性，說(shuō)明細(xì)胞株clone13-2-3為IgG1亞型，clone11-4-4為IgG2a亞型。

2.5 單克隆抗體的效價(jià) 采用間接 ELISA方法對(duì)2株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。從表2中可以看出，clone13-2-3與clone11-4-4的細(xì)胞上清液的OD值與SP2/0細(xì)胞上清液的OD值之比大于等于2.1的最高稀釋度分別是3 000和2 800。因此，clone13-2-3和clone11-4-4的細(xì)胞上清液中單克隆抗體效價(jià)分別為1∶3 000和1∶2 800;同理，表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，clone13-2-3和 clone11-4-4細(xì)胞株制備的腹水中單克隆抗體效價(jià)分別達(dá)到1∶12 000和1∶7 500。

圖1 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of standard substance

圖2 純品r LZ-8的液相色譜圖Fig.2 The chromatogram of r LZ-8

圖3 r LZ-8單克隆抗體液相色譜圖Fig.3 The chromatogram of Mb

圖4 Western blot膠片曝光圖Fig.4 Film picture of Western blot

表1 雜交瘤細(xì)胞亞型檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The determination result of their subtype of antibody of hybridoma line

表2 雜交瘤細(xì)胞上清液中單克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果Tab.2 The ELISA result of the monoclonal antibody from hybridoma cell culture

表3 小鼠腹水中獲得的單克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果Tab.3 The ELISA result of the monoclonal antibody from mouse ascites

2.6 單克隆抗體的特異性檢測(cè) Western blot膠片曝光方法檢測(cè)的結(jié)果顯示，clone13-2-3和clone11-4-4株單抗均能特異性識(shí)別rLZ-8蛋白，說(shuō)明兩株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體具有很強(qiáng)的特異性。

3 討論

本研究在國(guó)際相同領(lǐng)域研究中首次以高純度的rLZ-8作為免疫原反復(fù)免疫小鼠，按常規(guī)的單克隆抗體制備方法篩選出2株可產(chǎn)生抗rLZ-8抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并通過制備腹水的方法成功地獲得了編號(hào)為clone13-2-3和clone11-4-4的單克隆抗體，分別鑒定為IgG1亞型和IgG2a亞型。經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)，這2株雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體均可高特異性地識(shí)別rLZ-8，效價(jià)分別為1∶12 000和 1∶7 500。

rLZ-8作為一種免疫調(diào)節(jié)蛋白，不僅能夠抑制小鼠系統(tǒng)性過敏反應(yīng)、刺激人類外周血淋巴細(xì)胞增殖和高表達(dá)IL-2、TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子，還對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的殺傷作用［5-8］。但在闡釋其相關(guān)作用機(jī)理的研究過程中，包括rLZ-8的細(xì)胞亞定位、藥效學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)等研究均需要使用對(duì)rLZ-8具有高特異性識(shí)別作用的單克隆抗體，因此，其單克隆抗體的成功獲得將極大地推進(jìn)該蛋白的藥效學(xué)、藥理學(xué)及其他相關(guān)研究的進(jìn)程。

1 Liang CY，Zhang SQ，Sun F et al.Ganodermalucidumimmunomodulatory protein(Lz-8)expressed in Pichiapastoris and the identification of immunocompetence［J］.Chin JBiotech，2009;25(3):441-447.

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