何曉燁 蔡映云

(上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年病科，上海200032)

肺癌是當(dāng)今對(duì)人類(lèi)健康危害最大的腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展涉及環(huán)境、微生物、炎癥等眾多因素，同時(shí)還伴隨著機(jī)體免疫反應(yīng)的參與及最終免疫監(jiān)控機(jī)制的失調(diào)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，與腫瘤免疫逃逸過(guò)程有著密切的關(guān)系［1，2］。近年來(lái)普遍認(rèn)為可轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一個(gè)特征性標(biāo)志，是其獲得免疫調(diào)節(jié)特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。Foxp3能使初生CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞，該基因的正常表達(dá)是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮作用的前提［3］。

腫瘤微環(huán)境是近年來(lái)深入研究腫瘤局部淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用而提出的新概念，它主要指腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及少量浸潤(rùn)細(xì)胞，如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等共同組成［4］。抑制性免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中參與腫瘤組織與免疫系統(tǒng)相互作用的重要因素之一。檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)情況有助于更全面地了解腫瘤逃逸免疫監(jiān)視機(jī)制。

本研究主要觀察和比較了CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3基因在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的非小細(xì)胞肺癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)差異。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集46例于2008年5～12月間入住復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科的初診肺癌患者，均為未經(jīng)化療及其他生物治療的初治患者，不伴有自身免疫性疾病，均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌。其中男性24例，女性22例，有吸煙史9例。患者的平均年齡為(59.24±12.51)歲(38～86歲)，平均病程(3.23±4.71)個(gè)月(2天～24個(gè)月，中位數(shù)1月)。組織學(xué)類(lèi)型:腺癌36例、鱗癌8例、腺鱗癌2例。根據(jù)2003年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期21例、Ⅱ期8例、Ⅲ期13例、Ⅳ期4例。病理分級(jí):Ⅱ級(jí)29例、Ⅱ～Ⅲ級(jí)11例、Ⅲ級(jí)6例。所有入選患者均獲得知情同意。

1.2 主要儀器與試劑 OD260/280核酸定量分析儀(Pharmacia公司);PCR儀(PE公司);凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech公司);Bio-Rad 550分光光度儀(美國(guó)Bio-Rad公司);FACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司);IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(上海申騰信息技術(shù)有限公司);OLYMPUS BH2顯微鏡;PANASONIC MV-CP410攝像機(jī);淋巴細(xì)胞分離液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);PCR引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，F(xiàn)oxp3上游引物:5'-ACAGCACATTCCCAGAGTTCCT-3'，下游引物:5'-TCTCCACCCGCACAAAGCA-3';GADPH上游引物:5'-CCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游引物:5'-ATGACCTTGCCCACAGC-3';Trizol(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司);50 bp DNA ladder(北京天根生物技術(shù)公司);2×Pfu PCR master mix(北京天根生物技術(shù)公司);Foxp3抗體(eBioscience公司);EnVision兩步法試劑盒(DAKO公司);FITC-CD4和PE-CD25抗體(Invitrogen公司);TGF-β及IFN-γ的ELISA試劑盒(上海元象醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 標(biāo)本處理 采集肺癌患者空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血約4 ml，分為2份。一份離心后取血清置-20℃冰箱保存，待測(cè) TGF-β及 IFN-γ。另一份用肝素抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106～2×106ml-1，以流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

每例患者術(shù)中取50 mg大小的腫瘤組織，加入500 μl生理鹽水，用研磨杵頭在1.5 ml EP管中手動(dòng)研磨制備組織勻漿，5 000 r/min離心10分鐘后取上清液，待測(cè)TGF-β及IFN-γ。腫瘤組織及引流區(qū)淋巴結(jié)的石蠟切片取自術(shù)后的常規(guī)石蠟切片，切片厚度3 μm。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取100 μl PBMC加入10 μl FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4，PE標(biāo)記的CD25抗體，避光孵育30分鐘后加入PBS洗滌2次，2 000 r/min離心5分鐘后棄上清，加入500 μl PBS，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 RNA抽提及Real-time PCR 將肺癌患者的PBMC標(biāo)本用RNA抽提試劑盒提取總RNA，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以此RNA為模板，加入引物oligo(dT)18及Rnase-free水，65℃加熱5分鐘，迅速在冰上冷卻。再加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑，繼續(xù)反應(yīng)42℃ 50分鐘，99℃ 1分鐘。cDNA分別以GAPDH和Foxp3為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95℃ 5分鐘，94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒，72℃ 10分鐘，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，F(xiàn)oxp3擴(kuò)增片段192 bp，GAPDH擴(kuò)增片段450 bp，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照，灰度掃描分析結(jié)果。將目的條帶的灰度值與內(nèi)參的灰度進(jìn)行比對(duì)得到目的基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.6 TGF-β及IFN-γ檢測(cè) 分別取肺癌患者血清、腫瘤組織勻漿上清液各約100 μl加入待測(cè)孔，反應(yīng)板充分混勻后37℃下放置120分鐘，洗滌液洗滌反應(yīng)板4～6次后每孔加入第一抗體工作液50 μl，37℃下放置60分鐘;洗板后每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100 μl，37℃下放置60分鐘，洗板后每孔加入底物工作液100 μl，37℃暗處反應(yīng)5～10分鐘，每孔加1滴終止液混勻后于450 nm處測(cè)吸光值。分別于TGF-β和IFN-γ的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖上根據(jù)樣品的OD值查出相應(yīng)的TGF-β和IFN-γ值。

1.7 免疫組化 采用EnVision二步法。石蠟切片用二甲苯脫蠟，酒精梯度水化后9.0 EDTA 100℃加熱30分鐘，切片用0.3%H2O2處理5分鐘。用PBS洗片 3次，每次 2分鐘。加 50 μl Foxp3抗體(1∶50)，4℃過(guò)夜。再用 PBS洗片3次，每次2分鐘。加50 μl試劑盒中的抗鼠HRP聚合物，室溫放置30分鐘。PBS再次洗片3次，每次2分鐘。DAB顯色5～10分鐘，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水透明封片。

結(jié)果判斷:免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)生在不知道相關(guān)臨床資料的情況下進(jìn)行。于光鏡下(×200)隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察腫瘤組織內(nèi)、腫瘤組織與正常肺組織交界處以及淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞表達(dá)Foxp3的情況。然后采用IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)和醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，計(jì)算淋巴細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性Foxp3的OD值。

2 結(jié)果

根據(jù)肺癌患者是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(n=22)和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(n=24)，兩組的一般情況及臨床特點(diǎn)如表1所示。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者的臨床特點(diǎn)一覽表Tab.1 The clinical characteristics of non-small lung cancer patients

2.1 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的肺癌患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及Foxp3基因表達(dá)情況的比較 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的兩組肺癌患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞比例分別為41.00%±14.05%和43.62%±15.10%(表2，圖1)，F(xiàn)oxp3基因的相對(duì)表達(dá)量分別為1.01% ±0.51和0.92% ±0.41，組間比較均無(wú)顯著性差異(表2，圖2)。

2.2 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的肺癌患者腫瘤微環(huán)境及淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性Foxp3的情況比較在腫瘤微環(huán)境及淋巴結(jié)組織中，表達(dá)陽(yáng)性Foxp3的淋巴細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色(圖3)。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)表達(dá)Foxp3的陽(yáng)性程度要明顯強(qiáng)于未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(OD值16.43±3.07 vs 8.49±0.64，P＜0.05，表2);有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者腫瘤組織及腫瘤組織與正常肺組織交界處淋巴細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性Foxp3的OD值均明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者(腫瘤組織處16.89±3.12 vs 11.02±3.15，交界處15.71±3.27 vs 10.66 ±2.75，P ＜0.05，表2，圖3)。

表2 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的肺癌患者外周血及腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)情況及TGF-β、IFN-γ水平的檢測(cè)結(jié)果Tab.2 The expression of regulatory T cells and levels of TGF-β and IFN-γ in peripheral blood and tumor microenvironment of NSCLC patients with different lymph node metastasis situation

2.3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的肺癌患者外周血及腫瘤組織勻漿中TGF-β及IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果比較 兩組肺癌患者外周血中TGF-β水平分別為(68.04±9.80)pg/ml和(67.44 ± 9.62)pg/ml，IFN-γ 水平分別為(28.52±1.77)pg/ml和(30.88±10.78)pg/ml，組間比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05，表2)。

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者腫瘤組織勻漿中TGF-β水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者［(111.53 ±34.10)pg/ml vs(67.19 ±14.78)pg/ml］，差異具有顯著性(P＜0.05，表2)，但兩組的IFN-γ水平比較無(wú)顯著性差異［(27.75±25.01)pg/ml vs(28.27 ±11.65)pg/ml］，P ＞0.05，表2。

圖1 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的肺癌患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞比例比較Fig.1 Proportion of CD4+CD25+T in PBMC of NSCLC patients with different lymph node metastasis situation

圖2 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的肺癌患者外周血中Foxp3基因的表達(dá)Fig.2 Foxp3 expression in periphery blood of NSCLC patients with different lymph node metastasis situation

圖3 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的肺癌患者腫瘤微環(huán)境及淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性Foxp3的情況Fig.3 Foxp3 expression in lymphocytes of tumor microenvironment in NSCLC patients with different lymph node metastasis situation

3 討論

腫瘤患者引流區(qū)的淋巴結(jié)中存在著大量的免疫細(xì)胞，它們具有識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞的潛能，而腫瘤細(xì)胞仍然可以在其中存活并轉(zhuǎn)移，說(shuō)明在腫瘤侵襲的淋巴結(jié)中，免疫效應(yīng)細(xì)胞的增多受到了抑制，免疫狀況發(fā)生了改變。我們的研究顯示，在非小細(xì)胞肺癌患者轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞表達(dá)Foxp3的陽(yáng)性程度明顯強(qiáng)于未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)。這可能是因?yàn)槟[瘤的生長(zhǎng)促進(jìn)了CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在淋巴結(jié)中的增殖和分化;同時(shí)，增多的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增強(qiáng)了其免疫抑制作用，進(jìn)一步抑制了淋巴結(jié)內(nèi)的多種免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而促進(jìn)了淋巴結(jié)中腫瘤細(xì)胞的侵襲。在腫瘤免疫過(guò)程中，腫瘤抗原能夠被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除，對(duì)人體有著重要的保護(hù)作用。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可通過(guò)抑制CD4+CD25-T細(xì)胞和活化的CD8+CTL細(xì)胞等效應(yīng)T細(xì)胞的增殖［5，6］，抑制樹(shù)突細(xì)胞的成熟和抗原遞呈能力，以及參與多種細(xì)胞因子的相互作用來(lái)抑制機(jī)體抗腫瘤的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。

此外，我們的研究顯示，雖然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例和Foxp3基因的表達(dá)在兩組不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的非小細(xì)胞肺癌患者外周血中的比較無(wú)顯著性差異，但存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者在腫瘤組織、腫瘤組織與正常肺組織交界處中的Foxp3基因表達(dá)均明顯強(qiáng)于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者。Curiel等［7］學(xué)者認(rèn)為，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞能分泌趨化因子CCL22，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面高表達(dá)CCL22受體CCR4，因此盡管外周血中存在著效應(yīng)性CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞還是通過(guò)分泌趨化因子CCL22趨化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞向腫瘤局部特異性聚集，從而發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，這也是腫瘤免疫逃逸發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制。

腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制涉及多種機(jī)制，目前認(rèn)為主要有:①調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo)抗原提呈細(xì)胞(APC)表達(dá)B7-H4，B7-H4+APC能抑制T細(xì)胞的增殖周期;②調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過(guò)釋放穿孔素或粒酶直接殺傷T細(xì)胞和APC;③CYLA4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞誘導(dǎo) APC表面IDO的表達(dá)［8］，而IDO是降解色氨酸的酶，其表達(dá)一旦增加則會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)環(huán)境中缺少色氨酸，令蛋白質(zhì)合成受阻，從而影響T細(xì)胞的增殖和活化;④通過(guò)釋放IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子，抑制MHC分子、CD80、CD86等分子表達(dá)，抑制IL-12分泌，直接抑制T細(xì)胞活化和AK功能?？偠灾[瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞削弱了抗腫瘤免疫反應(yīng)，并能部分解釋T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的弱應(yīng)答現(xiàn)象。

腫瘤組織微環(huán)境中存在多種可以抑制效應(yīng)T細(xì)胞功能的細(xì)胞因子成分，這些細(xì)胞因子由腫瘤細(xì)胞本身或間質(zhì)細(xì)胞所分泌。我們的研究發(fā)現(xiàn)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者腫瘤組織勻漿中的TGF-β水平要明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者。TGF-β具有促進(jìn)和抑制細(xì)胞增殖的雙向作用，在免疫系統(tǒng)中表現(xiàn)出負(fù)調(diào)節(jié)因子效應(yīng)，可通過(guò)抑制MHC抗原表達(dá)、干擾樹(shù)突狀細(xì)胞的分化成熟誘導(dǎo)免疫耐受。在腫瘤組織微環(huán)境中，主要是通過(guò)影響效應(yīng)T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等發(fā)揮非特異性免疫抑制作用，同時(shí)TGF-β可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的擴(kuò)增，而擴(kuò)增的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞又可進(jìn)一步分泌 TGF-β［9，10］。

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