王燕萍 張 寧 沈曉燕 陳海波 胡云雁 譚芬來

浙江貝達(dá)藥業(yè)北京新藥研發(fā)中心，北京 100176

鉑類藥物是臨床治療腫瘤應(yīng)用較多的抗癌藥物之一，20世紀(jì)60年代順鉑（Cisplatin）抗癌作用的發(fā)現(xiàn)拉開了鉑類抗腫瘤藥物研究的序幕。隨著人們對(duì)金屬配合物的結(jié)構(gòu)和藥理作用認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入，新的高效、低毒、具有抗癌活性的鉑類配合物不斷被研制出來[1-2]，特別是順鉑和卡鉑（Carboplatin）是目前臨床上使用最廣的抗癌藥物之一，是治療許多腫瘤的首選藥物。但是目前臨床使用的鉑類抗癌藥對(duì)腫瘤細(xì)胞無特異選擇，導(dǎo)致用藥過程中出現(xiàn)副作用如神經(jīng)毒性、腎毒性、耳毒性、惡心嘔吐等，且容易產(chǎn)生耐藥性，這些因素限制了它們?cè)谂R床上更廣泛的應(yīng)用[2-5]。因此，尋找和設(shè)計(jì)合成出對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇殺傷作用、使用安全，而不易產(chǎn)生耐藥性的新一代鉑類抗癌藥已顯得十分迫切。BUT-6010是以順鉑、卡鉑的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，按照經(jīng)典的構(gòu)效關(guān)系設(shè)計(jì)和合成的新鉑類配合物，旨在通過改變載體或離子基團(tuán)來改善鉑類抗癌藥的藥代動(dòng)力學(xué)特性，以提高療效或降低毒副作用。本文旨在研究BUT-6010的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和動(dòng)物

HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、786-0、Caki-1、MDA-MB-231、HCT-116、NCI-H460、SK-OV-3 共 9 種人癌細(xì)胞株，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院干細(xì)胞醫(yī)學(xué)中心；健康ICR小鼠43只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004。

1.2 藥物

BUT-6010，由浙江貝達(dá)藥業(yè)提供，批號(hào)：20101227；順鉑，購于南京制藥廠有限公司，批號(hào)：20081202。

1.3 試劑和儀器

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞和PLC/PRF/5細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基，Hep3B細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基，786-0細(xì)胞株和NCI-H460細(xì)胞株用RPMI1640培養(yǎng)基，Caki-1細(xì)胞株、HCT-116細(xì)胞株和SKOV-3細(xì)胞株用McCoy's5A培養(yǎng)基，MDA-MB-231細(xì)胞株用L15培養(yǎng)基。細(xì)胞均在含10%FBS的培養(yǎng)液中37℃，5%CO2，95%濕度條件下培養(yǎng)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 體外對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用 腫瘤細(xì)胞株分為BUT-6010組、順鉑陽性對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組、培養(yǎng)基空白對(duì)照組。BUT-6010和順鉑稀釋成系列濃度100.000 0、31.600 0、10.000 0、3.160 0、1.000 0、0.316 0、0.100 0、0.031 6 μmol/L。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測定活細(xì)胞大于 95%。96 孔板中加 90 μL 細(xì)胞懸液，5×103cells/well，各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL相應(yīng)藥物溶液。培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL MTS/PMS混合液，總反應(yīng)體積 120 μL。 繼續(xù) 37°C、5%CO2培養(yǎng) 4 h，490 nm 處讀值[6]。

1.5.2 體內(nèi)對(duì)S180瘤重的影響 選擇S180瘤源動(dòng)物，脫頸處死，置于75%酒精中消毒2 min，剪開并剝?nèi)ジ共科つw，用空針吸取腹水10 mL，放入無菌離心管中離心（1 000 r/min），去上清液，加生理鹽水吹打細(xì)胞使之成為均勻溶液，二次離心，去上清液，再次洗滌，加生理鹽水吹打使之成為瘤細(xì)胞的均勻溶液，0℃保存。用生理鹽水稀釋細(xì)胞懸液至2×107個(gè)/mL，于右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL。接種后第5天小鼠按腫瘤體積分為5組：模型組、順鉑陽性對(duì)照組（2.5 mg/kg）、BUT-6010 30 mg/kg組、BUT-6010 20 mg/kg組、BUT-6010 10 mg/kg組。模型組腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射相對(duì)應(yīng)藥物，給藥體積為10 mL/kg，隔天給藥1次，給藥10 d。末次給藥48 h后脫頸椎處死小鼠，取腫瘤及各臟器（胸腺、心、肝、脾、肺、腎）稱重并記錄，統(tǒng)計(jì)各組瘤重、臟器系數(shù)，計(jì)算抑瘤率[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BUT-6010 對(duì) HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、786-0、Caki-1、MDA-MB-231、HCT-116、NCI-H460、SKOV-3這9種人癌細(xì)胞株的IC50均小于順鉑，見表1。

2.2 體內(nèi)對(duì)S180瘤重的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BUT-6010（30 mg/kg）和順鉑（2.5 mg/kg）均有顯著的抑瘤作用，均對(duì)動(dòng)物體重有影響，見圖1及表2。

3 討論

順鉑是目前臨床上使用最廣的抗癌藥物之一，其作用機(jī)制是與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，阻止DNA的合成與復(fù)制，抑制細(xì)胞分裂，最終殺死腫瘤細(xì)胞[7-10]。順鉑因其嚴(yán)重的毒副作用、低溶解性和耐藥性，限制了臨床應(yīng)用劑量和療效。經(jīng)歷了幾十年的研究發(fā)展，一系列鉑類化合物如卡鉑、奧沙利鉑、奈達(dá)鉑、庚鉑、洛鉑等已用于臨床治療癌癥[11]。這些鉑類化合物擴(kuò)大了抗癌譜，不同程度減輕了腎毒性、神經(jīng)毒性、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制等不良反應(yīng)?？鼓[瘤活性的廣譜性帶來的非特異性是造成毒副作用的主要原因，因此尋找在保留抗腫瘤活性基礎(chǔ)上具有低毒副作用的鉑類抗腫瘤藥物已成為當(dāng)前的主要研究方向。本實(shí)驗(yàn)改變順鉑或卡鉑配位體，設(shè)計(jì)了新型的順鉑或卡鉑類似物BUT-6010，旨在降低鉑類藥物耐藥性和毒性，改善治療效果。

表1 MTS法測BUT-6010對(duì)9種人源腫瘤細(xì)胞系的IC50

體外 9種人源腫瘤細(xì)胞株 HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5、786-0、Caki-1、MDA-MB-231、HCT-116、NCI-H460、SKOV-3篩選實(shí)驗(yàn)中，BUT-6010的IC50均小于順鉑，表明BUT-6010對(duì)在體外有廣譜抗腫瘤活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用強(qiáng)于順鉑。BUT-6010抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的強(qiáng)弱規(guī)律也基本類似于順鉑。S180荷瘤小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，BUT-6010（30 mg/kg）和順鉑（2.5 mg/kg）均有顯著的抑瘤作用，抑瘤率分別為52.8%、51.8%，同時(shí)BUT-6010的不良反應(yīng)導(dǎo)致的小鼠體重下降在高劑量時(shí)表現(xiàn)較明顯。試驗(yàn)需進(jìn)一步研究BUT-6010對(duì)其他類型動(dòng)物和人腫瘤模型的抗腫瘤作用，全面評(píng)價(jià)藥物體內(nèi)作用，逐步揭示抗其腫瘤活性機(jī)制，為臨床試驗(yàn)研究的開展提供依據(jù)。

表2 BUT-6010體內(nèi)對(duì)荷S180小鼠瘤重的影響

[1]Komeda S.Drug discovery research on in vivo antitumor-active azolatobridged dinuclear Pt（Ⅱ） complexes[J].Yakugaku Zasshi，2012，132（3）：253-259.

[2] 金雪梅.鉑類藥物的毒性作用與預(yù)防措施[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2010，26（21）：3294-3295.

[3]Uehara T，Yamate J，Torii M，et al.Comparative Nephrotoxicity of Cisplatin and Nedaplatin：Mechanisms and Histopathological Characteristics[J].J Toxicol Pathol，2011，24（2）：87-94.

[4]Amptoulach S，Tsavaris N.Neurotoxicity caused by the treatment with platinum analogues[J].Chemother Res Pract，2011，2011：843019.

[5]Kozubík A，Vaculová A，Soucek K，et al.Novel Anticancer Platinum（IV）Complexes with Adamantylamine：Their Efficiency and Innovative Chemotherapy Strategies Modifying Lipid Metabolism[J].Met Based Drugs，2008，2008：417897.

[6]王洪燕，全康，蔣燕靈，等.木犀草素抗腫瘤細(xì)胞增殖及增敏抗腫瘤藥物作用研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，39（1）：36-42.

[7]張佳麗，王增，莊蓓蓓，等.二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)氧化酶2抑制劑抗S180肉瘤作用機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（3）：308-312.

[8]宣麗君.吉西他濱聯(lián)合順鉑治療晚期乳腺癌的療效觀察[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18（5）：44-44.

[9]李喜茹.多西紫杉醇聯(lián)合順鉑同步放療不可手術(shù)胃癌的療效分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18（36）：66-67.

[10]李靜靜.順鉑聯(lián)合多西他賽或吉西他濱治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床對(duì)照研究[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18（11）：54-55，58.

[11]林曉雯，張艷華.鉑類抗腫瘤藥的進(jìn)展與臨床評(píng)價(jià)[J].中國醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2011，11（1）：4-6.