張 云 彭玄杰 張 興

(1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院,浙江 黃巖 318020；2.廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510120)

近年來(lái)研究表明胃癌的發(fā)生發(fā)展與Sonic hedgehog信號(hào)通路的異常激活有關(guān),以往對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Sonic hedgehog信號(hào)通路異常激活機(jī)制的研究主要集中于信號(hào)通路的上游配體Shh及其受體Ptch上,發(fā)現(xiàn)胃癌組織中存在Shh及Ptch的高表達(dá),并推測(cè)胃癌的發(fā)生可能與Sonic hedgehog信號(hào)通路上游配體Shh及其受體Ptch高表達(dá)有關(guān),但相關(guān)研究結(jié)果卻不能解釋作為抑癌基因的Ptch在胃癌組織中高表達(dá)的現(xiàn)象。Smo蛋白是Sonic hedgehog信號(hào)通路中的信息轉(zhuǎn)換器,對(duì)Sonic hedgehog信號(hào)通路具有激活作用,其在胃癌組織中的表達(dá)以及與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,目前尚不清楚。

本研究以正常胃黏膜組織作對(duì)照,檢測(cè)Smo mRNA及蛋白在胃癌組織中的表達(dá)狀況,分析胃癌組織中Smo表達(dá)水平與患者臨床及病理特征的關(guān)系,并進(jìn)一步探討在Sonic hedgehog信號(hào)通路中,Smo蛋白對(duì)于與胃癌的輔助診斷及預(yù)后判斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 68例胃癌及距離病灶5cm處正常胃黏膜組織標(biāo)本來(lái)自浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院2010年2月至2011年10月的胃癌手術(shù)病例,其中男43例,女25例,年齡28～75歲,平均(55.4±3.5)歲,所有入選病例術(shù)前均未接受放療、化療等先期治療措施,并嚴(yán)格按照TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為四期。手術(shù)標(biāo)本部分用石蠟包埋,部分于-80℃冰箱保存、備用。

1.2 方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為德國(guó)耶拿公司qTOWER產(chǎn)品。胰蛋白酶及TRIzol RNA提取試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。Smo單克隆抗體及S-P免疫組化染色試劑盒購(gòu)自上海英駿生物科技有限公司。PCR試劑盒由QIAGEN公司提供。PCR引物由上海西唐科技有限公司代為合成。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qRT-PCR)分析Smo mRNA表達(dá) 參照試劑盒說(shuō)明提取組織中的總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增反應(yīng)。Smo引物∶Sense 5-ACGCACAGAGGCGACTTGA-3,antisense 5-ATCATTGGCGTCCATAGG-3。β-actin引物∶Sense 5-GTCAATGACTCGAGGCCA-3,antisense 5-TACTTCGTCGAAGCACAA-3。循環(huán)擴(kuò)增條件為∶在93℃2m進(jìn)行預(yù)變性；循環(huán)周期40個(gè),順次包括93℃60秒,55℃60秒以及72℃20秒；最后在72℃條件下延伸7m。Smo擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為128bp。每個(gè)樣品均重復(fù)檢測(cè)3次。采用2△Ct法計(jì)算Smo相對(duì)表達(dá)量(△Ct=Smo Ct-β-actin Ct)[1]。

1.4 免疫組化法分析Smo蛋白分布及表達(dá) 具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,以試劑盒自帶的陽(yáng)性切片的免疫組化染色結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照,以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。圖像分析借助CMIAS多功能真彩色圖像分析系統(tǒng)完成。結(jié)果分析參考Yoshikawa等[2]判斷方法,將細(xì)胞膜和(或)胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞核和(或)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒的細(xì)胞視為陽(yáng)性細(xì)胞,隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比并賦予分值∶＜5%為陰性,賦分0；≥5%～35%為弱陽(yáng)性,賦分 1；≥35%～65%為陽(yáng)性,賦分2；≥65%為強(qiáng)陽(yáng)性,賦分3。染色強(qiáng)度按照3個(gè)視野總得分值分為0～9分,其中分值≥4為高表達(dá),＜4為低表達(dá)或無(wú)表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,Smo表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系采用Mann-Whitney和Kruskal-Wallis分析法。

2 結(jié) 果

2.1 Smo mRNA在胃癌及正常胃黏膜中的表達(dá)在胃癌組織及正常胃黏膜組織中Smo的相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.01983±0.001536)和(0.00862±0.002141)(P＜0.001),胃癌組織中Smo mRNA明顯高表達(dá)。

2.2 Smo蛋白在胃癌組織中的表達(dá) Smo陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞的胞膜上及胞漿內(nèi)；在正常胃黏膜中,只有約23%組織表達(dá)Smo,且表達(dá)強(qiáng)度多為弱陽(yáng)性；胃癌組織中Smo表達(dá)水平明顯增強(qiáng),在腫瘤細(xì)胞膜上及胞漿內(nèi)均可見(jiàn)濃染的棕黃色顆粒。在68例胃癌組織中,52例表現(xiàn)為Smo陽(yáng)性,陽(yáng)性表達(dá)率為76.5%,16例為陰性,陰性表達(dá)率為23.5%。35例胃癌標(biāo)本參照設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)為Smo高表達(dá)(51.5%),33例為低表達(dá)。詳見(jiàn)表1。

2.3 Smo蛋白表達(dá)水平與臨床及病理特征的關(guān)系

Smo蛋白表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織病理學(xué)分級(jí)、組織病理學(xué)分型(WHO分型)、淋巴結(jié)侵犯以及TNM分期的關(guān)系。結(jié)果顯示,Smo蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤大小(P=0.0026)、組織病理學(xué)分級(jí)(P=0.0168)、淋巴結(jié)侵犯(P=0.0251)以及TNM分期(P=0.0356)呈正相關(guān)(r 值分別為 0.423、0.387、0.542),而與性別 、年齡以及WHO分型無(wú)關(guān)。詳見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中Smo蛋白表達(dá)水平與臨床及病理特征的關(guān)系

3 討 論

Sonic hedgehog是人類胚胎發(fā)育過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞增殖和組織分化的重要信號(hào)通路之一。它主要是由細(xì)胞外分泌型信號(hào)糖蛋白Shh配體、細(xì)胞膜上跨膜蛋白受體Ptc和另一跨膜蛋白Smo組成的復(fù)合物,以及細(xì)胞漿內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶Fused(Fu)、Fu抑制劑(SuFu)、類運(yùn)動(dòng)蛋白Costal-2(Cos2)和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白(Gli1,Gli2,Gli3)組成[3_4],其中Smo蛋白是sonic hedgehog信號(hào)通路中的信息轉(zhuǎn)換器,它能夠?qū)⒓?xì)胞外的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞內(nèi)的Gli1信號(hào)[5],對(duì)Sonic hedgehog信號(hào)通路具有激活作用。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明,Sonic hedgehog信號(hào)通路存在兩種激活方式∶一是配體依賴性激活方式,即因Shh配體的過(guò)度表達(dá)而引起此信號(hào)通路中目的基因的轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展；二是配體非依賴性激活方式,即Smo等基因發(fā)生功能獲得性突變,從而導(dǎo)致Sonic hedgehog信號(hào)通路的異常激活,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6_8]。目前的研究表明,Smo基因在多數(shù)腫瘤組織,如肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等組織中有不同程度的表達(dá)上調(diào)[9_11]。同時(shí)有學(xué)者發(fā)現(xiàn),用 Smo拮抗劑 cyclopamine干預(yù)后的食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,凋亡增加[12]。上述現(xiàn)象均表明Sonic hedgehog通路激活在腫瘤發(fā)生過(guò)程中可能是一種普遍現(xiàn)象,并且與Smo異常表達(dá)有關(guān)。

本組結(jié)果顯示,Smo基因在胃癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常胃黏膜組織,與有關(guān)報(bào)道結(jié)果一致。免疫組織化學(xué)方法亦提示,在正常胃黏膜組織中,Smo蛋白不表達(dá)或弱表達(dá),而在胃癌組織中Smo蛋白表達(dá)陽(yáng)性率及表達(dá)強(qiáng)度均顯著上升,明顯高于正常胃黏膜,并隨著腫瘤體積的增大、胃腺癌分化程度下降、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期的惡化其表達(dá)水平明顯提高,從而進(jìn)一步表明Smo蛋白與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移之間存在密切關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)中的Smo蛋白表達(dá)水平與臨床及病理特征關(guān)系分析結(jié)果顯示,隨著腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲能力的增強(qiáng)以及病期的進(jìn)一步惡化,Smo蛋白表達(dá)水平明顯升高,提示Smo可能與胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān),Smo蛋白高表達(dá)的腫瘤可能具有更強(qiáng)的侵襲能力,從而嚴(yán)重影響患者的預(yù)后,而密切監(jiān)測(cè)Smo蛋白可能對(duì)判斷胃癌患者的預(yù)后提供有價(jià)值的信息。

本組結(jié)果顯示,Smo蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為76.5%,高表達(dá)率為51.5%,與其他部位腫瘤組織中Smo表達(dá)率接近[9_10],提示在胃癌組織中,Som蛋白表達(dá)及通路激活方式類似于其他腫瘤組織。

綜上所述,作者認(rèn)為Sonic hedgehog信號(hào)通路的異常激活可能直接參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程,而Smo蛋白的高表達(dá)則可能是Sonic hedgehog信號(hào)通路異常激活的機(jī)制之一。本組結(jié)果也顯示,16例Smo mRNA表達(dá)明顯高于正常胃黏膜組織的胃癌標(biāo)本中Smo蛋白表達(dá)為陰性,提示轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制亦參與了Smo對(duì)Sonic hedgehog信號(hào)通路的異常激活過(guò)程,但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

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