彭清潔 王 沖 胡長敏 陳穎鈺 晁 金 聞曉敏 姜 鵬 郭愛珍 ，3，4**

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070；4.國家肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室，武漢 430070；5.武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司，武漢 430070；6.武漢?？禒柲翗I(yè)有限公司，武漢 430070；7.武漢市蔡甸區(qū)畜牧獸醫(yī)局，武漢 430100

湖北天門某肉牛養(yǎng)殖場2012年4月初從長春營城子購入一批250kg左右的西雜牛，自購入15d左右肉牛開始發(fā)病，主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、拉血便和血尿、呼吸急促、關(guān)節(jié)腫大、體溫升高及精神沉郁。根據(jù)牛場主的介紹，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道資料，初步判定是長時間運輸，導(dǎo)致犢牛遭受擁擠、饑渴、強(qiáng)噪音等一系列環(huán)境因素應(yīng)激，致使?fàn)倥０l(fā)病。為確診病因，本試驗對病牛進(jìn)行剖檢取樣、致病菌常規(guī)分離純化、病原菌16sRNA鑒定和小鼠攻毒試驗。對心臟和腎臟組織樣品制作病理切片并觀察，可見心肌充血、出血及心肌纖維細(xì)胞變性壞死，腎臟淤血、水腫、腎小管變性壞死。

1 材料與方法

1.1 樣品

無菌采集病死牛心、肝、脾、肺和腎組織各1份。將采集的各臟器組織塊放入10%的福爾馬林溶液中固定（固定液的用量是采集組織病料的15倍），備用。

1.2 培養(yǎng)基

李斯特菌（LuriaBertani，LB）液體培養(yǎng)基：稱量胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl10g，溶解于ddH2O中；待其完全溶解后，再用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2，定容至1000mL；然后高壓蒸汽滅菌20min，室溫保存，備用。

胰蛋白胨大豆肉湯（TrypticsoyBroth，TSB）培養(yǎng)基，批號1091999，美國碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

胰蛋白胨大豆瓊脂（TrypticSoyAgar，TSA）培養(yǎng)基，批號1074969，美國碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號120514，杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，批號20110511-01，杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)，按照說明配制，高溫滅菌，備用。

支原體（Pleuropneumonia-LikeOrganisms，PPLO）固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基用于牛支原體的分離培養(yǎng)，配制所用肉湯粉、瓊脂粉等均由BD公司生產(chǎn)，參考文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，但未加1%醋酸鉈溶液。TSA、TSB購自上海生工生物工程有限公司，麥康凱購自杭州天和微生物試劑有限公司。

水培酪蛋白（M-H）瓊脂培養(yǎng)基，批號20110511，杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 藥敏紙片

青霉素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、克林霉素、恩諾沙星、頭孢氨芐、林可霉素、慶大霉素、新霉素、阿奇霉素、鏈霉素、先鋒必和紅霉素13種常用藥敏試紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司，批號為201108，-20℃密閉保存。

1.4 實驗動物

6只SPF設(shè)雌性昆明鼠，3周齡，體重20～25g，購于湖北省疾控中心。購買后，給予充足的飼料和飲水，按照相關(guān)實驗動物飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng)。5只小鼠隨機(jī)分配，分別注射從病牛心、肝、脾、肺、腎得到的組織物培養(yǎng)菌液，另1只用于設(shè)置對照，注射等量生理鹽水。

1.5 試驗方法

1）細(xì)菌的分離與純化。無菌操作，在無菌操作臺上，用消毒后的接種環(huán)穿刺所采集的心、肝、脾、肺、腎典型病變處，將采集好的病料劃線接種在TSA培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后分別觀察各培養(yǎng)基上生長菌落的顏色、形狀和大小等情況。

2）細(xì)菌的PCR鑒定。采用設(shè)計的引物，以細(xì)菌DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗和鑒定。

①細(xì)菌DNA模板的制備。將分離純化后的細(xì)菌菌株接種至TSB培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。取150μL過夜培養(yǎng)菌液，放入Eppendorf管中，煮沸 10min，冰浴 1min，12000r/min離心 30s，取上清液作為DNA模板。

②擴(kuò)增。16SrRNA通用引物序列為；16Sr-RNA-forward:5'-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3'、16SrRNA-reverse:5'-CGCGGATCCGCrACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系為50μL， 其 中 2×Taq Mixture（Tiangen）2.5μL，Primers（10μmol/L）各 2.0μL，DNA 模板 7.5μL，去離子水13.5μL。

PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性 10min后，94℃變 性 1min，55℃10min 退火 1min，72℃延 伸1min，30 個循環(huán)后，72℃延伸 10min。

3）牛支原體的分離與鑒定。無菌取小塊的肺組織樣品，涂于PPLO固體培養(yǎng)基表面，于含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時將小塊組織樣品投入到PPLO液體培養(yǎng)基中，2～3d后，用光學(xué)顯微鏡低倍鏡觀察菌落形態(tài)，支原體在固體培養(yǎng)基上應(yīng)具有“煎蛋樣”特征，液體培養(yǎng)基由紅色變黃色且透亮。

無菌操作，在無菌操作臺上，用無菌牙簽挑取牛支原體菌落于預(yù)加入150mL滅菌水的Eppendorf管中，煮沸 10min，冰浴 1min，12000r/min離心 30s，然后取上清液作為DNA模板。利用牛支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pMD18-T（寶生物工程大連有限公司）中，委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

牛支原體的特異性引物如下：SCl:5'-ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG-3'、SC2:5'-CTGATTATGATGACAGTGGTCA-3'。

PCR反應(yīng)體系為20μL，其中：2×TaqMixture（Tiangen）10μL，引物 SCl和 SC2（10μmol/L）各1.0μL，支原體DNA模板1.0μL，去離子水7.0μL。

表1 試驗用抗生素的種類、藥敏紙片含藥量及抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性45s，57℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)后，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為277bp。

4）藥敏試驗。采用瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥物敏感性試驗。所用培養(yǎng)基為水解酪蛋白（M-H）瓊脂培養(yǎng)基，所用的藥敏紙片有青霉素G（10μg/片）、強(qiáng)力霉素（30μg/片）、環(huán)丙沙星（5μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、克林霉素（2μg/片）、恩諾沙星（5μg/片）、頭孢氨芐（30μg/片）、林可霉素（2μg/片）、慶大霉素（10μg/片）、阿奇霉素（15μg/片）、新霉素(30μg/片)、先鋒必（75μg/片）和紅霉素（15μg/片）13種常用藥敏試紙片。運用瓊脂紙片擴(kuò)散法來測定分離到的細(xì)菌菌株對所選用的抗菌藥物試紙片藥物的敏感性。判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

5）病理切片、HE染色。病料取樣：主要取病變心臟組織，取幾塊相同大小的組織塊，放入液氮管，-80℃保存；取腎臟組織用4℃ 4%中性多聚甲醛溶液固定。選取的組織材料，厚度2～4mm，面積1.5～3.0cm×2.0cm為宜，一方面利于組織塊迅速固定，另一方面便于盡可能全面觀察病變。常規(guī)HE染色：固定好后，脫水，透明，石蠟包埋，制備4μm厚切片，常規(guī)HE染色。觀察并采圖：在光學(xué)顯微鏡下觀察所制作的切片并采圖。

6）小鼠攻毒試驗。待培養(yǎng)的細(xì)菌菌株活化以后以1∶1000的比例轉(zhuǎn)接到盛有5mLTSB的細(xì)菌瓶中，37℃搖床中震蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)到2.7左右（約4h）時開始處理細(xì)菌。

先取1mL菌液于1.5mLEP管中，8000r/min離心4min，用生理鹽水洗滌懸垂2次，之后轉(zhuǎn)入到盛有9mL生理鹽水的瓶中，再以1∶10的比例稀釋，一共得到3個梯度的菌液。

5只3周齡雌性昆明鼠，取過夜菌液200μL，注射小鼠腹腔內(nèi)，對照組小鼠注射等量的生理鹽水。其中注射有肺部細(xì)菌（天門）培養(yǎng)液的小鼠24h內(nèi)死亡，注射有氣管內(nèi)細(xì)菌（天門）培養(yǎng)液的小鼠48h內(nèi)死亡。解剖致死的小鼠，分別取其心、肝、脾、肺、腎接種分菌，PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床鑒定結(jié)果

圖1 病牛肺充血、出血、呈現(xiàn)肉變

圖5 脾縮水、出現(xiàn)褶皺

圖6 心臟充血、出血

根據(jù)病牛的臨床癥狀及牛場主口述的情況來看，病牛很可能是由于長時間的長途運輸使其產(chǎn)生應(yīng)激，不適應(yīng)新環(huán)境導(dǎo)致發(fā)病，初步診斷為運輸應(yīng)激綜合征。臨床上，病牛表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、呼吸急促、關(guān)節(jié)腫大及精神沉郁。剖檢可見牛肺充血、出血、呈現(xiàn)肉變，肺切面鈍圓呈暗紅色；支氣管有明顯白色泡狀物；關(guān)節(jié)腫大；脾縮水、表皮皺縮；心臟充血、出血，心腔內(nèi)有暗紅色積血（如圖1～6所示）。推測病牛有呼吸系統(tǒng)疾病。

2.2 細(xì)菌初步鑒定結(jié)果

在PPLO牛支原體專用培養(yǎng)基上，菌落生長良好，所有菌落呈典型的“油煎蛋狀”；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上有紅色菌落生成，形成圓形凸起，邊緣整齊、光滑菌落，直徑約2～3mm；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上，有黑色帶金屬閃光的菌落。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果見表2。

表2 藥敏試驗結(jié)果 mm

由表2可知，從該病牛病變組織中分離得到的細(xì)菌和支原體對本試驗中所用的常見藥敏紙片的耐藥性較嚴(yán)重；大腸桿菌、志賀氏菌僅對新霉素敏感，對其他抗生素不敏感；牛支原體對環(huán)丙沙星、恩諾沙星敏感，對其他抗生素不敏感。

2.4 PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果

對16SrRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，用BLAST軟件進(jìn)行序列同源性比較。結(jié)果表明：“油煎蛋狀”菌落為牛支原體，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生成的紅色菌落為大腸桿菌；在伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基上黑色帶金屬閃光的菌落為志賀氏菌。

2.5 病理切片、HE染色結(jié)果

本試驗將之前采集好的儲存在10%福爾馬林溶液中固定的病牛的心、肝、脾、肺和腎組織做了常規(guī)的石蠟切片，并且進(jìn)行了HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示病牛不同的組織器官有不同的病理變化，心、腎表現(xiàn)得尤為明顯。其中，心肌充血、出血，心肌纖維細(xì)胞變性壞死；腎淤血、水腫、腎小管變性壞死。

圖7 心肌病變組織的組織病理學(xué)觀察（HE染色，400×）

圖8 淤血、水腫、腎小管變性壞死（HE染色，400×）

圖9 小鼠剖檢病變組織病理變化

2.6 小鼠攻毒試驗結(jié)果

小鼠攻毒試驗表明：病牛肺組織細(xì)菌培養(yǎng)液的毒力最強(qiáng)，注射的小鼠24h內(nèi)死亡，剖檢可見肺充血、出血、肺泡內(nèi)有少量漿液性滲出物；其次是氣管細(xì)菌培養(yǎng)液，注射的小鼠48h內(nèi)死亡，剖檢可見小鼠肝淤血、腸絨毛膜損壞如圖9所示。撲殺小鼠后，無菌采集心臟血進(jìn)行細(xì)菌的分離和PCR鑒定，確認(rèn)其與牛肺中分離到的大腸桿菌和志賀氏菌一致。因此可以確診病牛發(fā)生了大腸桿菌和志賀氏菌的混合感染。

3 討論

3.1 臨床診斷

正常的運輸也會產(chǎn)生許多應(yīng)激，主要的應(yīng)激源是供水不足、擁擠、微生物影響、飼料影響等，其他如運輸前后飼養(yǎng)場地和環(huán)境變化、閹割、驅(qū)蟲等一些處理辦法，也會給牛造成應(yīng)激，所有的這些應(yīng)激都可能影響到牛對營養(yǎng)物質(zhì)的需要。而環(huán)境、應(yīng)激、營養(yǎng)3者之間又存在著一定的聯(lián)系。所以必須考慮選擇最大限度的發(fā)揮家畜生產(chǎn)性能的最合理的管理設(shè)施。

3.2 細(xì)菌鑒定

本試驗對牛場主送檢樣品進(jìn)行實驗室檢測，綜合判斷病牛為大腸桿菌、志賀氏菌與牛支原體混合感染。

牛大腸桿菌病是致病性大腸桿菌引起的、主要在新生犢牛中發(fā)生的急性傳染病，其最主要特征表現(xiàn)為敗血癥和劇烈的腹瀉，嚴(yán)重時可導(dǎo)致病牛脫水死亡。一般情況下，成年牛發(fā)病不致死。

目前，傳染性牛支原體肺炎已被認(rèn)為是育肥牛、犢牛等的呼吸道疾病與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的重要病因，同時，也是引發(fā)肉牛運輸應(yīng)激綜合征的主要病因。牛支原體常與細(xì)菌、病毒等共同作用，再加上一些環(huán)境因子（如天氣突變、通風(fēng)不良、擁擠等），更會加劇病情。臨床上用多種抗生素進(jìn)行治療，但效果不理想。該病例中，發(fā)病牛均為犢牛，且4月初剛從長春營城子運至湖北天門不久，北牛南運以及飼養(yǎng)條件改變等均可為支原體病的發(fā)生提供有利條件，而伴隨的細(xì)菌混合感染，更加導(dǎo)致病情復(fù)雜化。

志賀氏菌是由志賀氏菌引起的一種傳染病。志賀氏菌可以分成痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌4個血清群（種）。其中痢疾志賀氏菌感染最為嚴(yán)重，宋內(nèi)氏志賀氏菌引起的感染一般比較輕，福氏志賀氏菌容易轉(zhuǎn)變成慢性感染。近幾年發(fā)現(xiàn)，志賀氏菌不僅感染人，也可引起動物發(fā)病。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于志賀氏菌感染仔豬、幼犬、雞、鴨、犢牛等多種動物的報道，從而引起動物大批發(fā)病、死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。本病例中犢牛排血便、血尿，有可能是志賀氏菌感染了犢牛的腸道系統(tǒng)。但志賀氏菌為什么、如何侵襲直腸、結(jié)腸黏膜的機(jī)理暫時還不清楚。有研究認(rèn)為是直腸、結(jié)腸黏膜在志賀氏菌存在的條件下對急性水腫異常敏感而導(dǎo)致；但也有研究認(rèn)為是因為志賀氏菌表達(dá)的是一個結(jié)腸特定的黏附系統(tǒng)。有待進(jìn)一步研究。

3.3 大腸桿菌、志賀氏菌與牛支原體耐藥性

藥敏試驗是研究藥物抑制、殺滅細(xì)菌的機(jī)理以及指導(dǎo)臨床用藥的依據(jù)之一。細(xì)菌接觸到抗生素以后，就處于生長和被抗生素抑制的競爭環(huán)境，故任何一個影響細(xì)菌生長分裂的因素都可以影響到抗生素對細(xì)菌的殺滅作用?？股乜梢詥蛹?xì)菌的凋亡機(jī)制，而細(xì)菌則可以通過包括基因突變在內(nèi)的各種方式存活下來。

研究表明，從20世紀(jì)80年代到現(xiàn)在，志賀氏菌已對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性?？股氐拇罅俊V泛使用是導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生的原因之一，細(xì)菌暴露在抗生素中的時間越長，其獲得耐藥性的幾率就越高。另有研究表明，志賀氏菌具有耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥范圍廣等特點，對氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素等廣譜抗菌素的多重耐藥性逐年上升，對抗生素的耐藥率逐年提高，多重耐藥菌株的耐藥譜也在逐年增加。本試驗的研究表明，志賀氏菌對新霉素較敏感，臨床上可用其治療疾病。志賀氏菌對臨床上常使用的環(huán)丙沙星等抗生素敏感性很差，故可表明這些抗生素對細(xì)菌性痢疾已無多大療效，而青霉素、鏈霉素對菌痢的治療不起任何作用。

藥敏試驗還表明，傳統(tǒng)治療大腸桿菌的藥物（如慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢類藥物）對分離到的菌群均具有敏感性，如果及時使用，能很好地控制疫情。但大腸桿菌病對常用的抗生素的敏感性越來越弱，因而耐藥菌株日益增多。據(jù)文獻(xiàn)資料，從各地的各種動物中分離到的大腸桿菌對抗生素的敏感性差異很大，目前也較難確定一個能普遍適用的抗菌藥物敏感譜。臨床建議治療細(xì)菌性疾病的時候，最好選用經(jīng)抗生素敏感試驗確定為高度敏感的藥物進(jìn)行治療，如此才能收到良好的治療效果。另外，本試驗表明支原體對環(huán)丙沙星、恩諾沙星敏感。另據(jù)文獻(xiàn)報道，在不同牛場分離到的牛支原體對藥物的敏感性有較大差異，故在臨床使用時，也應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗來確定治療用藥物。早期使用泰樂菌素類（替米考星）及泰妙菌素類（支原凈）抗菌藥，對犢牛支原體病有一定療效。

3.4 臨床建議

綜合以上信息，該肉牛場的肉牛是混合感染了大腸桿菌、志賀氏菌與牛支原體而導(dǎo)致發(fā)病，根據(jù)以前報道的文獻(xiàn)資料及本次藥敏試驗結(jié)果，給牛場主以下臨床建議。

1）抗菌消炎。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，大腸桿菌、志賀氏菌對新霉素敏感，故可用新霉素制劑對發(fā)病牛群進(jìn)行抗菌消炎。

2）對癥治療。對于發(fā)熱的牛可用解熱藥，如安乃近、復(fù)方氨基比林；對于喘氣嚴(yán)重的牛應(yīng)用支氣管擴(kuò)張藥，如氨茶堿；同時由于肺炎導(dǎo)致肺水腫，可給以利尿脫水藥，如呋塞米，用量為0.5～1.0mg/kg體重，2次/d；對于體質(zhì)弱的牛補(bǔ)充能量、維生素C和復(fù)合維生素B。

3）牛舍和運動場要嚴(yán)格消毒。另一方面，由于肉牛在長途運輸過程中會受到不同程度的應(yīng)激影響，運輸?shù)竭_(dá)目的地之后要重新適應(yīng)新環(huán)境、飼料等，對生長非常不利。因此不建議從外地引進(jìn)牛；如果可能，各牛場應(yīng)按就近原則引進(jìn)牛。如必須在外地引進(jìn)，引進(jìn)新牛群前，應(yīng)對牛舍進(jìn)行徹底地清洗、消毒，并對原有牛群進(jìn)行免疫接種預(yù)防措施。新引進(jìn)牛群在運輸過程中應(yīng)該給予合理的飼養(yǎng)管理及飲水，忌太擁擠，引進(jìn)后，注意日糧的合理搭配。

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