胥 穎，何 娟，徐科偉，肖 嬌

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院病理科，四川 成都 610072)

病理組織石蠟切片制作，首先經(jīng)過組織固定，隨后是脫水、透明、浸蠟處理，這些步驟通過全自動密閉式組織脫水機來完成。我科在1998、2004、2008年先后購置日本櫻花(SAKURA)公司3種不同型號全自動密閉式組織脫水機，在使用過程中我們出現(xiàn)過操作不當(dāng)，也積累了經(jīng)驗，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 材料:我院活檢標(biāo)本和外科手術(shù)標(biāo)本。儀器:SAKURA VIP-ETP-300型、Tissue-Tek-VIP5型和Tissue-Tek-VIP6型全自動密閉式組織脫水機，為日本原裝進(jìn)口，每臺附帶不銹鋼脫水籃2只，可容納300個包埋盒，塑料包埋盒為國內(nèi)產(chǎn)品。

表1 常用組織標(biāo)本處理程序

1.2 方法

1.2.1 組織固定 新鮮組織取材后，裝入寫有外檢編號的塑料包埋盒內(nèi)，放入AAF液(甲醛150 ml、85%乙醇800 ml、冰醋酸50 ml配成1000 ml)中固定1～3 h后，不經(jīng)水洗直接進(jìn)入脫水機進(jìn)行組織處理，處理時間從pm5:00至次日am8:00，共計15小時。

1.2.2 編輯程序 根據(jù)工作時間的不同設(shè)置多個處理程序，在顯示屏操作界面“菜單”上進(jìn)行人機對話，將相關(guān)數(shù)據(jù)輸入脫水機，完成程序編輯。

1.2.3 常用組織標(biāo)本處理程序 見表1

2 結(jié)果

經(jīng)該程序處理的組織標(biāo)本脫水、透明和浸蠟充分，軟硬適中，有彈性，效果好，組織切片厚2～3 μm，厚薄均勻，染色鮮艷，色澤清晰絢麗。制作的切片達(dá)到優(yōu)質(zhì)切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 HE染色 組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核染色質(zhì)、核膜界限清楚，胞漿及間質(zhì)染色鮮艷(圖1)。

2.2 特殊染色 Masson、PAMS、PAS、GMS、Alcian blue、Giemsa、Gondon-Sweet、AgNOR、石碳酸復(fù)紅、亞甲藍(lán)等染色，色澤艷麗，層次清楚，對比明顯(圖2、圖3)。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 CEA、CK、Vimentin、

GFAP、CD20、CD45、Ki67等免疫標(biāo)記及癌基因蛋白產(chǎn)物c-erbB-2、p53抗癌基因蛋白、乳腺激素受體ER、PR檢測，組織切片中棕黃色反應(yīng)產(chǎn)物清晰可見，陽性著色強度明顯，界限清楚，定位準(zhǔn)確(圖4)。

3 討論

3.1 固定 固定的目的是保存組織和細(xì)胞。關(guān)鍵在于組織固定是否及時有效，與組織取材的大小、厚薄有關(guān)。組織標(biāo)本若固定不當(dāng)，在后期切片制作過程中則無法糾正和補救。最常用固定液是10%中性緩沖甲醛和Lillie氏AAF固定液。①10%中性緩沖甲醛固定液對科研標(biāo)本具有良好的固定作用，用于快速固定效果不理想。中性緩沖甲醛固定液中的磷酸鹽會在組織中沉積，形成結(jié)晶妨礙組織切片制作［1］。②AAF固定液具有快速、均勻、滲透力強、組織收縮小等優(yōu)點，作為取材后的補充固定，效果更加明顯，既能保證良好組織形態(tài)，又適合各種組織化學(xué)染色。

圖1 骨髓穿刺石蠟切片，HE染色;圖2 腎活檢穿刺石蠟切片，Masson染色;圖3 淋巴結(jié)石蠟切片，AgNOR染色;圖4 肺癌組織中CK-7陽性(EnVision兩步法)

3.2 組織處理 包括脫水、透明和浸蠟，目的是除去組織中水分，通過中間媒介浸入石蠟，來完成組織處理。使用全自動密閉式組織脫水機的加熱功能，保持在恒溫條件下處理組織效果更佳。

3.2.1 脫水 利用乙醇將組織內(nèi)的水分置換出來，有利于二甲苯的滲入，乙醇是最好的脫水劑。脫水不足或過度都會影響組織處理，常見問題有:①脫水過度引起組織發(fā)硬，甚至強烈收縮;②脫水不足組織柔軟，是乙醇使用過久濃度降低所致，不能很好地脫水并直接影響組織的透明和浸蠟。

3.2.2 透明 為了使石蠟浸入到組織塊內(nèi)，使用一種既能和乙醇混合，又能與石蠟相融的透明劑，這一過程稱透明或媒浸，最好的透明劑是二甲苯。近年來一些替代二甲苯的環(huán)保透明劑問世，如TO型、康柏氏ETC、宏慈Van-Clear和格林GS等透明劑。

3.2.3 浸蠟 浸蠟的石蠟為54～56℃軟蠟。第一缸石蠟內(nèi)加硬脂酸，石蠟100 g加硬脂酸5 g。在浸蠟時要防止因溫度過高，造成處理過度，發(fā)生組織硬、脆等改變或溫度過低，影響組織浸蠟效果，導(dǎo)致切片制作困難。浸蠟較好的組織是硬有彈性。

3.3 儀器清洗 ①組織處理程序完成后，在清洗脫水機前再次啟動排出功能，點“Pump Out”鍵，將殘留在管道內(nèi)的蠟液排盡后，用吸水紙或脫脂棉將處理槽內(nèi)殘留蠟液和組織碎屑?xì)堅猎嚫蓛?，然后進(jìn)入清洗程序，能有效地防止管道堵塞。②密閉式脫水機在使用過程中各種試劑，都是通過同一管道抽入或排出處理槽，其底部有一個圓形過濾器漏孔，為防止過濾器漏孔堵塞，應(yīng)將過濾器取出進(jìn)行清洗，將濾網(wǎng)上黏附的固體污物、沉渣和油脂等清除，保持濾網(wǎng)通暢，每月清洗一次。③要注意脫水機蓋板和密封圈的清潔，殘留的石蠟及雜質(zhì)要及時清除，保證處理槽的密閉效果。

3.4 試劑更換 以標(biāo)本量作為衡量標(biāo)準(zhǔn)［2］，定期更換試劑，更換試劑的原則是:如試劑瓶容量為3700 ml，每處理5000個標(biāo)本后應(yīng)更換試劑。將乙醇、二甲苯和石蠟第1試劑瓶液體廢棄，將后面試劑瓶按順序前移，并補足液體，最后1瓶更換新液，SAKURA VIP-ETP-300型沒有自動換液功能，Tissue-Tek-VIP5型和Tissue-Tek-VIP6型都有外部充裝/排放自動換液功能。在更換試劑時盡量少用自動換液功能，尤其是對儀器使用不熟練者，最好采用手動更換試劑，既可避免操作失誤的發(fā)生，又能保證儀器正常運行。

3.5 氣壓/真空(P/V)循環(huán)及攪拌系統(tǒng) 采用P/V循環(huán)和攪拌功能，是全自動密閉式組織脫水機設(shè)計新理念［3，4］。使用時應(yīng)根據(jù)乙醇、二甲苯和石蠟使用時間的長短來選擇，不能所有步驟都選擇P/V循環(huán)和攪拌功能，否則會造成組織脫水、透明和浸蠟過度，使組織發(fā)干、扭曲變形和變脆。①P/V循環(huán)功能主要作用是向處理槽內(nèi)加壓和抽真空交替進(jìn)行;②攪拌功能是將試劑反復(fù)泵入泵出以加快乙醇、二甲苯和石蠟與組織內(nèi)成份交換，使組織脫水、透明和浸蠟更快速、更徹底。在組織標(biāo)本需要作快速處理時使用P/V循環(huán)和攪拌功能，可在6小時內(nèi)可以完成組織標(biāo)本整個處理程序。

3.6 常見故障 脫水機在某一道程序停機報警:①更換試劑后，試劑瓶安裝不到位。②試劑太少，沒有及時補充。③管壁污垢脫落形成栓子沉積造成管道堵塞，尤其在冬季。④蓋板密封圈表面和周圍有石蠟殘留，產(chǎn)生漏氣現(xiàn)象。⑤過濾網(wǎng)有殘渣吸附，試劑交換受阻。⑥氣壓真空泵壓力不足。第①～⑤故障技術(shù)人員可以自己解決。第⑥故障請維修人員檢修。

［1］馬恒輝，周曉軍.組織固定處理及包埋常見問題與對策［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2011，26(6):638.

［2］鄭暉，顏亞暉，朱文兵.全自動組織脫水機試劑的更換［J］.診斷病理學(xué)雜志，2010，17(5):399.

［3］John DB，Marilyn G.周小鴿，劉勇，主譯.組織學(xué)技術(shù)的理論與實踐［M］.第6版.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010:72-77.

［4］梁英杰，凌啟波，張威.臨床病理學(xué)技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:12-13.