呂長(zhǎng)維，陶黎明，徐文平

(1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 200237)

間二硝基苯的還原產(chǎn)物間苯二胺、間硝基苯胺都是重要的中間體，廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、制藥、染料以及農(nóng)藥工業(yè)；而且由間苯二胺與苯二甲酰氯合成的耐高溫芳香聚酰胺樹(shù)脂和阻燃纖維具有許多特殊用途(如用于防護(hù)服、航空航天材料等[1])，因此需求量大增。目前工業(yè)化生產(chǎn)芳香胺主要是利用有機(jī)合成中的一個(gè)重要單元反應(yīng)——芳香族硝基化合物的還原反應(yīng)，實(shí)際生產(chǎn)中已有許多經(jīng)典的方法，例如鐵粉還原、堿性條件下用磺化物還原、水合肼還原、電解還原以及催化加氫還原等等[2,3]，然而這些方法的反應(yīng)過(guò)程需要高壓、易燃?xì)錃?、有害溶劑或?huì)發(fā)生重金屬中毒等[4,5]。因此，高效安全地制備芳香胺依然是有機(jī)合成中的一個(gè)重要研究方向。

生物催化技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、專(zhuān)一性強(qiáng)等特點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注，并已廣泛應(yīng)用于制藥和精細(xì)化工領(lǐng)域。已有許多文獻(xiàn)報(bào)道了微生物降解環(huán)境中芳香族硝基化合物的研究[6,7]。Soojhawon等[8]利用AcinetobacterjuniiA8將對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯胺、對(duì)硝基甲苯、間硝基甲苯和2,4,6-三硝基甲苯等化合物在有氧條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，最終降解為直鏈化合物。Li等[9]則利用啤酒酵母制備芳基羥胺，反應(yīng)底物主要包括對(duì)二硝基苯、鄰二硝基苯、對(duì)甲磺基硝基苯等。但迄今未見(jiàn)利用微生物對(duì)間二硝基苯進(jìn)行轉(zhuǎn)化的報(bào)道。

在篩選具有還原芳香族硝基化合物能力的微生物的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一批細(xì)菌和放線(xiàn)菌具有還原硝基的能力，特別是1株地衣芽孢桿菌CGMCC2280，可以以間二硝基苯為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。作者在此對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離、鑒定、轉(zhuǎn)化影響因素和轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和培養(yǎng)基

間硝基苯胺(純度≥98%)、間苯二胺(純度≥98%)，美國(guó)Aldrich公司；鄰二硝基苯(純度≥98%)，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；鄰硝基苯胺(純度≥98.5%)，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；間二硝基苯、間硝基苯羥胺、對(duì)二硝基苯、對(duì)硝基苯胺，純度≥98%，常熟華泰化工廠(chǎng)；液相用甲醇、乙腈，色譜純，美國(guó)Merck公司；葡萄糖、蔗糖，市售分析純。

分離培養(yǎng)基Ⅰ(%)：葡萄糖1，酵母提取物0.5，可溶性淀粉2，碳酸鈣 1，N-amine 0.5，稀釋5倍后使用。

分離培養(yǎng)基Ⅱ(%)：可溶性淀粉0.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.1，酵母膏0.1，牛肉膏0.1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母浸膏10，蛋白胨10，氯化鈉10，氯化鈷0.005，磷酸氫二鉀0.05，氯化鎂0.005。

1.2 菌株的篩選和鑒定

將采集的土壤樣品用水稀釋后，涂布于分離培養(yǎng)基Ⅰ，28 ℃培養(yǎng)7 d后，挑選各單菌落分別培養(yǎng)于分離培養(yǎng)基Ⅱ。將配制好的間二硝基苯水溶液(200 mg·L-1)在100 ℃消毒20 min后，加入到預(yù)先配制并消毒的分離培養(yǎng)基Ⅱ中，使間二硝基苯終濃度為20 mg·L-1，倒入預(yù)先消毒的平皿中，待冷卻凝固后，將上述分離的不同的菌種接種于平皿中。培養(yǎng)皿在暗室中37 ℃放置48 h。然后在每個(gè)平皿中分別加入13 mL 0.21%的三氯乙酸溶液和0.007%的亞硝酸鈉溶液，室溫放置20 min。再加入1 mL 0.5%的氨基磺酸銨溶液，室溫下保溫3 min。最后在每個(gè)平皿中加入5 mL 0.1%的N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽溶液，室溫下仔細(xì)觀察平皿中的菌落，將染上紫紅色的菌株作為下一步復(fù)篩的備選菌[10]。

陽(yáng)性菌株B.licheniformisCGMCC2280的培養(yǎng)特征、生理生化特征鑒定根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[11]進(jìn)行。DNA提取及16S rDNA的擴(kuò)增和測(cè)序按文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行，將所測(cè)的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行分析比較，確定菌株的分類(lèi)。

1.3 菌株的培養(yǎng)

將上述染色陽(yáng)性菌株B.licheniformisCGMCC2280接種于LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)好的菌種接種到已消毒的發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL搖瓶裝量50 mL，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)30 h左右。離心收集菌體，用磷酸緩沖溶液(50 mmol·L-1Na2HPO4/KH2PO4，pH值8.0)洗滌2次，然后用10 mL緩沖溶液混合均勻得靜息細(xì)胞懸浮液，供生物轉(zhuǎn)化用。

1.4 生物轉(zhuǎn)化

先將過(guò)量的間二硝基苯結(jié)晶加入磷酸緩沖溶液中使其飽和。在100 mL錐形瓶中加入20 mL上述飽和緩沖溶液和0.5 g葡萄糖，攪拌溶解后再加入5 mL靜息細(xì)胞懸浮液，在30 ℃下220 r·min-1搖床振蕩轉(zhuǎn)化20 h，離心(1000×g，15 min)除去菌體，上清液用于HPLC分析。同時(shí)設(shè)定無(wú)底物對(duì)照和無(wú)菌空白對(duì)照。

在轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中，在指定的時(shí)間取樣0.1 mL,同樣處理后進(jìn)行HPLC分析。

在碳源影響實(shí)驗(yàn)中，以不加葡萄糖為空白對(duì)照，分別用等量的蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖代替葡萄糖。以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少3個(gè)重復(fù))的平均值為實(shí)驗(yàn)值。

1.5 HPLC分析

底物和產(chǎn)物的濃度測(cè)定采用HPLC法。

Agilent 1100型液相色譜儀，色譜條件：反相色譜柱(ODS C18,2.5 mm×20 mm,0.5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水混合液(35∶15∶50，體積比)，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.6 中間體和產(chǎn)物的大量制備

將B.licheniformisCGMCC2280斜面菌種接種于裝有300 mL已消毒LB培養(yǎng)基的1 L搖瓶中，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)20 h，接種到裝有10 L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動(dòng)發(fā)酵罐(BIOSTAT?C，B.Braun International，Germany)中，37 ℃下通氣(1∶0.4，體積比)攪拌(400 r·min-1)培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液用自動(dòng)冷凍離心機(jī)(20PR-52D，HITACHI，Japan)離心(1000×g，15 min)后，將菌體懸浮在10 L轉(zhuǎn)化液(含2%葡萄糖的磷酸緩沖溶液，pH值8.0)中，加入2.5 g間二硝基苯，在14 L自動(dòng)發(fā)酵罐中36～38 ℃攪拌轉(zhuǎn)化反應(yīng)。0.5 h后取1 L反應(yīng)液終止反應(yīng)，加入1 L氯仿萃取2次，合并萃取液，低溫減壓(15 ℃，0.096 MPa)濃縮得到固體，用甲醇溶解后進(jìn)一步用制備型HPLC[Shimadzu LC10A，甲醇-乙腈-水=35∶15∶50(體積比)]純化，低溫減壓(15 ℃，0.096 MPa)濃縮后得到217 mg化合物A(純度98.2%)。反應(yīng)2 h后再取1 L反應(yīng)液，同前操作，得到187 mg化合物B(純度99.4%)。反應(yīng)24 h后，用2.5 L乙酸乙酯萃取4次，合并有機(jī)相，減壓濃縮得到1.27 g近無(wú)色固體，在甲醇-苯混合液(5∶1，體積比)中重結(jié)晶，得到純度為98%以上的化合物C。

1.7 中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

用LC-MS(Agilent LC/MSD)測(cè)定中間體和產(chǎn)物的質(zhì)譜；用NMR(Varian INOVA 400 MHz)測(cè)定中間體和產(chǎn)物的氫譜和碳譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離和鑒定

從500株菌中初篩出126株菌落染有紫紅色(表明菌落在生長(zhǎng)時(shí)可能具有將間二硝基苯還原成間硝基苯胺或間苯二胺的能力)的菌株，再經(jīng)過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)一步進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)19株菌株具有還原間二硝基苯的能力，其中1株菌株具有顯著的還原能力。該菌株菌體呈桿狀，培養(yǎng)36 h左右后產(chǎn)生芽孢，芽孢中生；營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，初期菌落呈光滑狀，后期呈列液狀，邊緣毛發(fā)褶皺。生理生化實(shí)驗(yàn)表明該菌革蘭氏染色陽(yáng)性，可水解明膠、淀粉，葡萄糖產(chǎn)酸，甲基紅實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，可耐受7%的氯化鈉和60 ℃高溫。16S rDNA(GenBank No.EU200968)分析表明，該菌與地衣芽孢桿菌的序列相似度為99%。綜合其形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷該菌株屬于地衣芽孢桿菌CGMCC2280(BacilluslicheniformisCGMCC2280)。

2.2 反應(yīng)中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

LC-MS顯示化合物A分子量為154，1HNMR顯示在苯環(huán)上有4個(gè)氫，各氫位移值和歸屬為：7.25(1H，s，2-H)，7.46(1H，t,3J4-5=7.91，3J6-5=8.05，5-H)，7.80(1H，d,3J=7.91，4-H)，7.90(1H，d,3J=8.05,6-H)，位于低場(chǎng)的有2個(gè)活潑氫。從而推斷化合物A為間硝基苯羥胺。

化合物B和C分別與間硝基苯胺和間苯二胺標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致；LC-MS分析表明，它們的分子量和碎片峰也與標(biāo)準(zhǔn)品相同，1HNMR數(shù)據(jù)也一致。從而確定化合物B和C分別為間硝基苯胺和間苯二胺。

各化合物的1HNMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 中間體和產(chǎn)物的1HNMR數(shù)據(jù)

2.3 底物選擇性

分別以間二硝基苯、間硝基苯胺、鄰二硝基苯、鄰硝基苯胺、對(duì)二硝基苯、對(duì)硝基苯胺6種化合物作為生物轉(zhuǎn)化的底物，考察菌株的底物選擇性，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可看出，該菌株優(yōu)先轉(zhuǎn)化間位或鄰位二硝基底物，很難轉(zhuǎn)化對(duì)位二硝基底物。

表2 地衣芽孢桿菌對(duì)不同硝基化合物的選擇性還原

注：轉(zhuǎn)化率為被轉(zhuǎn)化底物的毫摩爾數(shù)與加入底物的毫摩爾數(shù)之比，用HPLC測(cè)定

2.4 pH值和溫度的影響

設(shè)定pH值為8.0、溫度為26～42 ℃，每隔2 ℃為一個(gè)區(qū)間，振蕩反應(yīng)20 h后，液相測(cè)定被轉(zhuǎn)化的底物量和產(chǎn)物的生成量，考察溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。設(shè)定溫度為37 ℃、pH值為4.5～10.0，振蕩反應(yīng)20 h后，液相測(cè)定被轉(zhuǎn)化的底物量和產(chǎn)物的生成量，考察pH值對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 pH值和溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響

由圖1可看出，該菌株的最適反應(yīng)pH值為7.5～9.0，最適反應(yīng)溫度為30～38 ℃。

2.5 糖類(lèi)的影響

地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉(zhuǎn)化間二硝基苯反應(yīng)體系各物質(zhì)濃度與轉(zhuǎn)化時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)圖2。

a.加2%葡萄糖 b.未加葡萄糖

由圖2可知，轉(zhuǎn)化液中添加2%的葡萄糖，有利于地衣芽孢桿菌對(duì)間二硝基苯的還原作用。在含有葡萄糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)初速度明顯比不加葡萄糖時(shí)要快，轉(zhuǎn)化4 h后產(chǎn)物間苯二胺的濃度仍然不斷增大，但增幅趨緩(圖2a)；在不加葡萄糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)初速度較慢，產(chǎn)物間苯二胺的最高濃度較低，尤其是反應(yīng)14 h后，濃度反而不斷減小(圖2b)。說(shuō)明間二硝基苯的還原作用需要葡萄糖代謝提供能量和還原力，但該菌在沒(méi)有葡萄糖存在的情況下，可直接通過(guò)進(jìn)一步降解產(chǎn)物間苯二胺而維持反應(yīng)所需的能量。

2.6 溶劑對(duì)反應(yīng)進(jìn)程及反應(yīng)產(chǎn)物的影響

研究發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙醇或丙酮的濃度超過(guò)20%時(shí)，可徹底終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以丙酮為反應(yīng)抑制劑終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在不同時(shí)間加入丙硐對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間加入丙酮對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響

注：底物初始濃度1.5 mmol·L-1；轉(zhuǎn)化率為減少的間二硝基苯毫摩爾數(shù)與投入反應(yīng)的間二硝基苯的毫摩爾數(shù)之比，用HPLC測(cè)定

由表3可看出，在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)加入丙酮，底物轉(zhuǎn)化率為1.3%，微量的間硝基苯羥胺可瞬間生成；在反應(yīng)0.5 h時(shí)加入丙酮，底物轉(zhuǎn)化率為91.3%，中間產(chǎn)物間硝基苯羥胺占91.2%，而間硝基苯胺只占產(chǎn)物的8.8%，無(wú)間苯二胺生成；在反應(yīng)2 h時(shí)加入丙酮，底物基本被轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)99.6%，主要產(chǎn)物為間硝基苯胺(占66.4%)，間硝基苯羥胺比例已降至12.1%，而間苯二胺則由0%上升至21.5%；在反應(yīng)8 h時(shí)加入丙酮，主要產(chǎn)物變?yōu)殚g苯二胺(占75.2%)，間硝基苯羥胺比例降至0%，而間硝基苯胺比例也降至24.8%。因此，可以確定地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯的轉(zhuǎn)化過(guò)程是先形成間硝基苯羥胺，再形成間硝基苯胺，最后形成間苯二胺，如圖3所示。

圖3 地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉(zhuǎn)化間二硝基苯的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程

2.7 討論

目前，關(guān)于微生物進(jìn)行芳香族硝基還原研究的報(bào)道主要是集中于環(huán)境中芳香硝基化合物的微生物降解，如對(duì)三硝基甲苯(TNT)、硝基苯(MNT)以及2,4-二硝基甲苯(DNT)的降解研究[13,14]。Schenzle等[15]利用Ralstoniaeutropha菌產(chǎn)生的3NP硝基還原酶，對(duì)2-氯-5-硝基酚進(jìn)行化學(xué)選擇性還原，形成相應(yīng)的羥胺化合物，并對(duì)硝基苯、間二硝基苯、均三硝基苯、13種硝基酚、MNT、DNT和TNT等38種化合物進(jìn)行了底物適應(yīng)性比較，發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)2-氨基-4-硝基甲苯的還原活性最高，與NADPH酶的相對(duì)活性為219；而對(duì)間二硝基苯的相對(duì)活性只有12。Li等[9]則利用啤酒酵母將對(duì)二硝基苯、鄰二硝基苯、對(duì)甲磺基硝基苯等轉(zhuǎn)化為羥胺，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的比例與酵母的使用量有關(guān)，當(dāng)反應(yīng)底物濃度為100 mg·(100 mL)-1時(shí)，使用5 g干重的酵母可以使對(duì)二硝基苯近100%地還原為對(duì)硝基苯羥胺和對(duì)硝基苯胺，兩者的比例為95∶5，但對(duì)間二硝基苯的轉(zhuǎn)化作用未提及。Li等[16]還利用葡萄皮細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)選擇性還原芳香族硝基化合物來(lái)制備相應(yīng)的羥胺，進(jìn)行反應(yīng)的化合物有8-硝基-1,3-二氧基-苯基[de]吡喃、8-硝基-1,3-二氧基-苯基[de]-N-特丁基異喹啉、8-硝基-1,3-二氧基異吲哚、7-硝基-1,3-二氧基異吲哚、對(duì)二硝基苯和2-氰基-4-硝基苯腈，經(jīng)過(guò)6 d的轉(zhuǎn)化，前4種化合物轉(zhuǎn)化為羥胺均有較高的轉(zhuǎn)化率，而對(duì)后2種則無(wú)轉(zhuǎn)化效果，對(duì)間二硝基苯的轉(zhuǎn)化作用也未提及。本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了利用地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯來(lái)制備間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺的方法。而且根據(jù)丙酮對(duì)反應(yīng)的抑制作用原理，通過(guò)在不同的反應(yīng)時(shí)間添加丙酮終止反應(yīng)以控制反應(yīng)進(jìn)程，可以得到不同的反應(yīng)產(chǎn)物，以適應(yīng)不同的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物要求。根據(jù)反應(yīng)進(jìn)程可以確定本研究中地衣芽孢桿菌還原間二硝基苯的轉(zhuǎn)化過(guò)程是先形成間硝基苯羥胺，再進(jìn)一步形成間硝基苯胺，這一過(guò)程與其它芳香胺的形成原理基本一致[7,17～19]。

Blackie等[20]在研究酵母菌還原硝基和亞硝基化合物的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)條件不同可以發(fā)生2種不同類(lèi)型的反應(yīng)，第一類(lèi)型的反應(yīng)中加入糖可促進(jìn)胺類(lèi)化合物的生成。Li等[9]在制備芳羥胺的反應(yīng)體系中也加入了2%的葡萄糖，但并未對(duì)葡萄糖的影響作說(shuō)明。尹萍等[21]篩選了17株能夠降解TNT的酵母和類(lèi)酵母菌，并發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入一定量的碳、氮源可以促進(jìn)降解。李湛江等[22]利用吉氏擬桿菌和尿擬桿菌與葡萄糖共代謝降解硝基苯，但在不加葡萄糖的情況下降解活性為零，認(rèn)為這是由于這些菌株不能以硝基苯為唯一碳源的緣故。而本實(shí)驗(yàn)中的地衣芽孢桿菌即使在沒(méi)有葡萄糖的情況下，開(kāi)始也能將底物迅速降解，只是隨后將部分產(chǎn)物降解，以維持菌體活力而導(dǎo)致產(chǎn)物生成率下降。因此，在利用地衣芽孢桿菌CGMCC2280轉(zhuǎn)化制備間硝基苯胺，尤其是間苯二胺的時(shí)候，需要加入少量的葡萄糖等碳源，以提高轉(zhuǎn)化率，同時(shí)可以避免產(chǎn)物被進(jìn)一步降解。

根據(jù)B.licheniformisCGMCC2280的轉(zhuǎn)化進(jìn)程，可以清楚地發(fā)現(xiàn)該菌在轉(zhuǎn)化間二硝基苯的過(guò)程中，將間二硝基苯還原為間硝基苯羥胺是一步快速的酶促反應(yīng)，無(wú)論葡萄糖是否加入，都不影響這步反應(yīng)的進(jìn)行。但是正如溶劑影響實(shí)驗(yàn)中所揭示的那樣，由于丙酮對(duì)細(xì)胞間二硝基苯還原酶具有抑制作用，因此在各反應(yīng)階段加入丙酮等溶劑后，即可終止反應(yīng)。據(jù)此在轉(zhuǎn)化反應(yīng)進(jìn)行0.5 h后加入丙酮溶劑終止反應(yīng)，可以很方便地得到中間產(chǎn)物間硝基苯羥胺，而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的間硝基苯胺和間苯二胺，這也為制備采用化學(xué)合成手段難以得到的間硝基苯羥胺提供了一條新的途徑。

Li等[9]認(rèn)為酵母菌對(duì)底物的選擇性與苯環(huán)上所連接基團(tuán)的特性有關(guān)，基團(tuán)吸電性越強(qiáng)，轉(zhuǎn)化越容易進(jìn)行；如果是供電子基團(tuán)則轉(zhuǎn)化無(wú)法進(jìn)行。但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻表明底物選擇性與基團(tuán)的吸電性沒(méi)有顯著的相關(guān)性，如鄰二硝基苯和對(duì)二硝基苯的電子云分布相似，但地衣芽孢桿菌CGMCC2280對(duì)兩者的轉(zhuǎn)化率卻有很大的差別；即使對(duì)鄰硝基甲苯這樣有供電子基團(tuán)的化合物，該菌依然具有很好的轉(zhuǎn)化活性(數(shù)據(jù)未列出)。這些結(jié)果表明地衣芽孢桿菌CGMCC2280對(duì)底物的選擇性主要與化合物的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3 結(jié)論

從土壤中篩選得到1株轉(zhuǎn)化間二硝基苯的芽孢桿菌，經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列分析，確定其為地衣芽孢桿菌CGMCC2280。對(duì)含間二硝基苯的菌體轉(zhuǎn)化液在不同時(shí)間取樣，分離純化得到化合物A、B和C，通過(guò)LC-MS和1HNMR分析，同時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，確定化合物A、B和C分別為間硝基苯羥胺、間硝基苯胺和間苯二胺。底物特異性表明，該菌對(duì)間二硝基苯和鄰二硝基苯的底物轉(zhuǎn)化率10 h達(dá)到98%以上，但對(duì)對(duì)二硝基苯的底物轉(zhuǎn)化率卻不到10%。轉(zhuǎn)化液中葡萄糖具有促進(jìn)間二硝基苯還原的作用，在沒(méi)有葡萄糖存在的情況下，轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度較慢，且反應(yīng)后期反應(yīng)產(chǎn)物間苯二胺會(huì)進(jìn)一步降解。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)的不同時(shí)間加入丙酮終止反應(yīng)并進(jìn)行產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)該菌還原間二硝基苯的轉(zhuǎn)化過(guò)程是先形成間硝基苯羥胺，再形成間硝基苯胺，最后形成間苯二胺。

(致謝:感謝華東理工大學(xué)李忠教授在核磁共振測(cè)定方面的幫助!感謝上海南方農(nóng)藥研究中心陸迪生先生在LC-MS測(cè)定中給予的幫助!)

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