朱秀良,王海燕,李 寧,林 毅,李曉露,張雪霞,蔣 沁
(微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心,華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司,河北 石家莊 050015)
雷莫拉寧(Ramoplanin,A-16686,MDL62)是一種新型的糖肽類(lèi)抗生素,由意大利Cavalleri等[1]在游動(dòng)放線菌(Actinoplanessp.)中首次分離得到,主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng),其純品是由A1、A2、A3、A1′、A2′、A3′、Ramoplanose等7個(gè)組分組成的混合物,其中A2為主要成分,占75%左右[2]。
雷莫拉寧抑制細(xì)胞壁上肽聚糖的生物合成,其抑菌機(jī)制與萬(wàn)古霉素及替考拉寧的抑菌機(jī)制不同;在體內(nèi)、體外的試驗(yàn)中,雷莫拉寧均表現(xiàn)出良好的廣譜抗菌活性,大部分病原菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)對(duì)雷莫拉寧敏感性均高于萬(wàn)古霉素和替考拉寧;雷莫拉寧的細(xì)胞毒性要比其它糖肽類(lèi)抗生素小且無(wú)明顯不良反應(yīng)及腎毒性[2]。因此,雷莫拉寧用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌引起的感染性疾病前景較好。
目前,關(guān)于雷莫拉寧的分離純化研究較少,且已有的制備工藝繁瑣、成本高、所得產(chǎn)品純度低[3~5]。作者在此根據(jù)雷莫拉寧化學(xué)結(jié)構(gòu)中羥基多的特點(diǎn),以聚酰胺樹(shù)脂為分離介質(zhì),從發(fā)酵液中分離純化雷莫拉寧,并對(duì)吸附及解吸條件進(jìn)行了優(yōu)化,以期得到高純度雷莫拉寧。
雷莫拉寧發(fā)酵液,華藥集團(tuán)新藥公司;雷莫拉寧標(biāo)準(zhǔn)品,自制;大孔樹(shù)脂LX-2000、LX-18,西安藍(lán)曉科技有限公司;大孔樹(shù)脂HZ801,上海華震科技有限公司;聚酰胺樹(shù)脂,上海滬峰生物科技有限公司;珍珠巖助濾劑,廊坊三新珍珠巖制品有限公司;去離子水,自制;乙腈(色譜純),美國(guó)Merck公司;工業(yè)乙醇,滄州興隆化工有限公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
高效液相色譜儀(996檢測(cè)器,515泵),Waters公司;Loborata 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,Heidolph公司;TGL-16G型高速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。
色譜柱:Agilent Eclipe XDB C8(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-酸水(0.1% H3PO4)(80∶20,體積比);流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL。
在發(fā)酵液中加入5%~7%珍珠巖助濾劑,攪拌30 min,真空抽濾,用水洗滌得菌絲體;將菌絲體用適量80%乙醇-酸水(pH值3.0~3.5)攪拌下浸泡2 h,真空抽濾,得雷莫拉寧浸提液。
根據(jù)雷莫拉寧弱極性及多羥基的特性,分別量取LX-2000、LX-18、HZ801和聚酰胺等4種弱極性吸附樹(shù)脂20 mL于4根適當(dāng)?shù)牟Aе校瑥闹斪⑷肜啄瓕幗嵋褐劣心繕?biāo)產(chǎn)物從樹(shù)脂柱上流出時(shí),停止上樣。以樹(shù)脂對(duì)雷莫拉寧的絕對(duì)吸附量為指標(biāo),并參照解吸收率進(jìn)行篩選。
1.5.1 雷莫拉寧浸提液濃度的選擇
將雷莫拉寧浸提液用NaOH溶液調(diào)pH值為6.5~7.5,減壓濃縮除去乙醇,濃縮液過(guò)濾除去不溶物,再加去離子水稀釋成不同濃度(μg·mL-1):400、800、1200、1600、2000、2400、2800、3200,分別上聚酰胺樹(shù)脂柱(樹(shù)脂裝量20 mL,流速1.0 BV·h-1),HPLC在線檢測(cè),當(dāng)有目標(biāo)產(chǎn)物流出時(shí),停止上樣,計(jì)算吸附量,確定最佳雷莫拉寧浸提液濃度。
1.5.2 吸附流速的選擇
選擇流速(BV·h-1)分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0,每10 mL流出液為一個(gè)樣品,測(cè)其濃度,計(jì)算泄漏率,確定最佳吸附流速。
取200 mL處理好的聚酰胺樹(shù)脂裝柱,將1000 mL 1600 μg·mL-1雷莫拉寧浸提液從柱頂注入,控制流速為1.0 BV·h-1。上樣完畢,依次采用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、60%、70%、80%的乙醇解吸,解吸流速為0.5 BV·h-1。分段收集解吸液,HPLC在線檢測(cè),計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸收率,并結(jié)合解吸液質(zhì)量確定最佳解吸條件。
45 ℃下,將解吸液減壓濃縮至20 mg·mL-1左右,攪拌下緩緩加入8~10 BV丙酮,室溫靜置4 h,抽濾,丙酮洗滌,真空干燥,得到雷莫拉寧白色結(jié)晶粉末。
表1 不同類(lèi)型樹(shù)脂對(duì)雷莫拉寧的吸附量及解吸收率
由表1可知,聚酰胺樹(shù)脂對(duì)雷莫拉寧的吸附量和解吸收率明顯大于其它樹(shù)脂,可以達(dá)到對(duì)雷莫拉寧的富集作用,而且聚酰胺樹(shù)脂的解吸液顏色較淺。故選用聚酰胺吸附樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.2.1 雷莫拉寧浸提液濃度對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響(圖1)
圖1 雷莫拉寧浸提液濃度對(duì)聚酰胺樹(shù)脂吸附量的影響
由圖1可見(jiàn),在相同的流速下,雷莫拉寧浸提液濃度越低,吸附量越高,但生產(chǎn)周期越長(zhǎng);雷莫拉寧浸提液濃度過(guò)高,又不利于樹(shù)脂吸附,吸附量較低。因此,選擇雷莫拉寧浸提液濃度為1600~2000 μg·mL-1。
2.2.2 吸附流速對(duì)樹(shù)脂吸附量的影響(圖2)
圖2 吸附流速對(duì)聚酰胺樹(shù)脂吸附量的影響
由圖2可見(jiàn),吸附流速大于1.0 BV·h-1后,泄漏率明顯升高;而吸附流速為0.5 BV·h-1與1.0 BV·h-1時(shí)的泄漏率相差不大。因此,選擇吸附流速為1.0 BV·h-1。
用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫樹(shù)脂,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的解吸收率
Tab.2Desorptionyieldatdifferentvolumefractionsofethanol
乙醇體積分?jǐn)?shù)%解吸液體積/mL濃度/μg·mL-1純度/%解吸收率%306000-0506002715.00.360600111085.535.670600173392.660.28060040.279.71.2
由表2可知,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于50%時(shí),洗脫的是一些色素和雜質(zhì);乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),洗脫不完全,解吸收率僅35.6%,這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)低,樹(shù)脂孔徑未能充分溶脹,不利于雷莫拉寧在乙醇中的溶解;乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)的解吸液濃度最高,且雜質(zhì)較少,純度也相對(duì)較高,說(shuō)明70%乙醇有利于目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫;乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),解吸液濃度很低,純度也不高,解吸收率僅1.2%,說(shuō)明目標(biāo)產(chǎn)物已被洗脫完全。故,確定洗脫條件為:先用30%或50%乙醇洗去極性大的雜質(zhì),再用70%乙醇洗脫。
將解吸液減壓濃縮至20 mg·mL-1左右,加入8~10 BV的丙酮,靜置4 h后,抽濾,用丙酮洗滌,真空干燥,得到純度大于95%的雷莫拉寧晶粉。
在上述最佳分離純化工藝條件(以聚酰胺樹(shù)脂作為分離介質(zhì),雷莫拉寧浸提液濃度1600~2000 μg·mL-1,吸附流速1.0 BV·h-1,乙醇作洗脫劑)下,連續(xù)進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
由表3可知,在最佳分離純化工藝條件下,總收率均超過(guò)80%、產(chǎn)品純度大于95%。
采用聚酰胺吸附樹(shù)脂分離純化發(fā)酵液中的雷莫拉寧,在雷莫拉寧浸提液濃度為1600~2000 μg·mL-1、吸附流速為1.0 BV·h-1、乙醇作洗脫劑(先用30%或50%乙醇洗脫,再用70%乙醇洗脫)時(shí),可得到高純度雷莫拉寧,總收率超過(guò)80%,純度大于95%。該方法簡(jiǎn)單易行,收率穩(wěn)定,安全性高,適合工業(yè)化生產(chǎn)。
參考文獻(xiàn):
[1] Cavalleri B,Pagani H,Volpe G,et al.A-16686,a new antibiotic fromActinoplanes.I.Fermention,isolation and preliminary physico-chemical characteristics[J].J Antibiot,1984,37(4):309-317.
[2] 郭月玲,趙子弟,倪慧敏,等.新型糖肽類(lèi)抗生素雷莫拉寧研究進(jìn)展[J].河北化工,2011,34(8):28-31.
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