成 丹 ，李健和 ，彭詞艷 ，曾小慧 ，3，易利丹

(1.湖南省湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院藥劑科，湖南 湘鄉(xiāng) 411400;2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長(zhǎng)沙 410011; 3.中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

賴氨酸是人體8種必需氨基酸之一，能促進(jìn)人體發(fā)育、增強(qiáng)免疫功能，并有提高中樞神經(jīng)組織功能的作用[1－2]。目前開發(fā)上市的注射制劑有鹽酸賴氨酸注射液、注射用鹽酸賴氨酸、鹽酸賴氨酸氯化鈉注射液、鹽酸賴氨酸葡萄糖注射液[3－7]，臨床上用于治療顱腦外傷、慢性腦組織缺血、缺氧性疾病的腦保護(hù)劑[8－10]。鑒于鹽酸賴氨酸本身無(wú)紫外吸收，亦不產(chǎn)生熒光，且注射用鹽酸賴氨酸系主藥鹽酸賴氨酸以注射用水加熱溶解并經(jīng)針用活性炭脫色后直接凍干而成的制劑，制劑中無(wú)其他任何輔料。為此，參照2010年版《中國(guó)藥典(二部)》鹽酸賴氨酸原料藥建立了非水電位滴定法測(cè)定注射用鹽酸賴氨酸含量，并與柱前衍生化高效液相色譜法進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－10Avp型高效液相色譜儀(日本島津);SPD－10Avp型紫外檢測(cè)器;分析之星色譜工作站;FA1004N型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。鹽酸賴氨酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為160732－201008，含量為99.6%);鹽酸賴氨酸原料藥(晉州冀榮氨基酸有限公司，批號(hào)為20101005，含量為99.2%);注射用鹽酸賴氨酸(由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部提供，規(guī)格為 1.5 g/瓶，批號(hào)為 20110214，20110215，20110216);2，4－二硝基氟苯為衍生化試劑，甲醇、乙醇均為色譜純，水為重蒸餾水，碳酸氫鈉、醋酸鈉、冰醋酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 非水電位滴定法

2.1.1 測(cè)定方法確定

由于注射用鹽酸賴氨酸處方中未加任何輔料，故參考2010年版《中國(guó)藥典(二部)》鹽酸賴氨酸的含量測(cè)定方法，擬訂本品的測(cè)定方法為高氯酸滴定法。取裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物約80 mg，精密稱定，加醋酸汞試液5 mL，振搖使溶解，加冰醋酸25 mL，照電位滴定法[2010年《中國(guó)藥典(二部)》附錄ⅦA]，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL高氯酸滴定液(0.1 mol/L)相當(dāng)于 9.133 mg 的 C6H14N2O2·HCl。

2.1.2 方法學(xué)考察

空白干擾試驗(yàn):不加鹽酸賴氨酸，采用上述方法滴定，結(jié)果消耗高氯酸滴定液(0.1052 mol/L)0.02 mL。

精密度試驗(yàn):取鹽酸賴氨酸對(duì)照品約80 mg，共6份，精密稱定，按上述方法測(cè)定。結(jié)果平均含量為99.5%，RSD為0.33%。

回收率試驗(yàn):取鹽酸賴氨酸約64，80，96 mg，各3份，精密稱定，用上述方法滴定。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 非水電位滴定法測(cè)定鹽酸賴氨酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批樣品，稱取6份裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物約80 mg，精密稱定，用上述方法滴定。結(jié)果平均含量為99.7%，RSD為0.35%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2 高效液相色譜法

2.2.1 色譜條件

色譜柱:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Phenomenex C18柱(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.05 mol/L 醋酸鈉和醋酸溶液(60 ∶40);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm，柱溫:40℃;進(jìn)樣量:20 μL。理論板數(shù)按鹽酸賴氨酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1000。

2.2.2 溶液制備

稱取鹽酸賴氨酸對(duì)照品約15 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加蒸餾水適量，振搖使溶解，加蒸餾水稀釋至刻度，然后精密吸取5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，加1%2，4－二硝基氟苯乙腈溶液2.5 mL和5%碳酸鈉溶液2.5 mL，搖勻，于80℃水浴反應(yīng)20 min，放冷，加pH為7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。稱取注射用鹽酸賴氨酸約15 mg，精密稱定，置250 mL量瓶中，加蒸餾水適量，振搖使溶解，加蒸餾水稀釋至刻度，然后精密吸取5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，按對(duì)照品溶液的制備法制備供試品溶液。精密吸取蒸餾水5.0 mL，置50 mL棕色量瓶中，按對(duì)照品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

空白干擾試驗(yàn):分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜圖相同保留時(shí)間有相應(yīng)的峰，陰性對(duì)照品溶液無(wú)對(duì)應(yīng)峰，無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:分別稱取鹽酸賴氨酸對(duì)照品約5，10，15，20，25 mg，精密稱定，依法制備對(duì)照品溶液，分別量取20 μL，注入液相色譜儀，以質(zhì)量濃度 C對(duì)主峰面積 A進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 A=24135 C－13191，r=0.9995。結(jié)果表明，鹽酸賴氨酸質(zhì)量濃度在2.0～10.0 μg/mL的范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):取線性關(guān)系考察項(xiàng)下質(zhì)量濃度為6.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，精密量取20 μL連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果主峰面積的平均值為131764，RSD為0.41%。

重復(fù)性試驗(yàn):取批號(hào)為20110215的樣品5份，各精密稱取15 mg，依法制備供試品溶液并測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算其標(biāo)示百分含量。結(jié)果平均含量為100.9%，RSD為0.35%。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別在 0，2，4，6，8，12 h 時(shí)取樣測(cè)定。結(jié)果主峰面積的平均值為131807，RSD為0.48%，表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):取鹽酸賴氨酸約12，15，18 mg各3份，精密稱定，按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 衍生化高效液相色譜法測(cè)定鹽酸賴氨酸的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品含量測(cè)定

分別采用非水滴定法和高效液相色譜法測(cè)定3批樣品的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(標(biāo)示量的%)

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道鹽酸賴氨酸的含量測(cè)定方法有電位滴定法[11－12]、柱前衍生化高效液相色譜法[13－15]、陽(yáng)離子交換色譜高效液相色譜法[6]、蒸發(fā)光散射檢測(cè)高效液相色譜法[7]、與茚三酮反應(yīng)顯色后可見(jiàn)分光光度法[16]等。蒸發(fā)光散射檢測(cè)高效液相色譜法往往受設(shè)備條件限制，與茚三酮反應(yīng)顯色后可見(jiàn)分光光度法誤差較大，故在參考上述相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)分別采用非水電位滴定法和柱前衍生化高效液相色譜法進(jìn)行注射用鹽酸賴氨酸的含量測(cè)定，并對(duì)兩種方法測(cè)得的3批樣品含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明，兩者都可準(zhǔn)確地用于本品的含量測(cè)定，測(cè)得3批樣品的含量基本一致，均可為該藥物的質(zhì)量控制提供保證。但兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，柱前衍生化高效液相色譜法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，但操作繁雜，衍生化反應(yīng)所需試劑難得;非水電位滴定法測(cè)定其電位突躍明顯、易辨、精密度和重復(fù)性良好、操作簡(jiǎn)便、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，能夠滿足其質(zhì)量控制，更適合于常規(guī)檢測(cè)。因此，采用非水電位滴定法測(cè)定本品含量。根據(jù)本品所用的測(cè)定方法及試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，并參照2010年版《中國(guó)藥典(二部)》對(duì)注射劑的一般規(guī)定要求，擬訂本品含量限度，含鹽酸賴氨酸(C6H14N2O2·HCl)應(yīng)為標(biāo)示量的 95.0% ～ 105.0%。

[1]陸志范，周全保.賴氨酸的藥用功能[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，1996，14(4):255－256.

[2]Nester WE.The metabolic roles，pharmacology and toxicology of lysine[J].J Am Coll Nutr，1997，16(1):7－21.

[3]陳國(guó)輝，李健和，彭詞艷，等.鹽酸賴氨酸注射液的研制[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17(16):17 －19.

[4]李健和，崔 巍，萬(wàn)小敏，等.注射用鹽酸賴氨酸的制備與穩(wěn)定性考察[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(5):673 －675.

[5]鄧曉彬，李健和，黎銀波，等.鹽酸賴氨酸氯化鈉注射液的研制[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，4(1):71 －75.

[6]孫會(huì)永，張志遠(yuǎn)，栗彩紅.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸賴氨酸葡萄糖注射液的含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2005，14(6):48－49.

[7]凌 林.HPLC－ELSD法測(cè)定鹽酸賴氨酸葡萄糖注射液的含量[J].藥物分析雜志，2007，27(3):454 －456.

[8]姚 煒，庫(kù)寶善，李中華.L－賴氨酸對(duì)大鼠腦損傷的作用[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，37(4):282 －284.

[9]姚 煒，庫(kù)寶善，張疆寅，等.L－鹽酸賴氨酸對(duì)局部腦缺血大鼠的治療作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34(6):401 －406.

[10]林茂暉，林日天.鹽酸賴氨酸治療100例輕中型腦損傷療效觀察[J].福建醫(yī)藥雜志，2002，24(6):152 －153.

[11]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:796.

[12]左詠軍，宋衛(wèi)中，張利民.注射用鹽酸賴氨酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3(12):149 －150.

[13]凌笑梅，劉養(yǎng)清，杜 鳴.用高效液相色譜－紫外檢測(cè)法測(cè)定賴氨酸注射液中賴氨酸含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(5):349－352.

[14]農(nóng) 輝，廖孫啟.鹽酸賴氨酸及其注射液的HPLC測(cè)定[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2003，32(2):33 －34，37.

[15]孫向紅，張建華.HPLC法測(cè)定鹽酸賴氨酸的含量[J].齊魯藥事，2010，29(6):345－346.

[16]程曉梅，尚 偉，王 娜.可見(jiàn)分光光度法測(cè)定鹽酸賴氨酸含量[J].長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，19(6):37.