王林麗，孟德勝，彭亦新

(中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所大坪醫(yī)院藥學(xué)部，重慶 400042)

痛風(fēng)利濕口服液是由大黃、山楂、王不留行等中藥制成的復(fù)方制劑，具有外散風(fēng)邪、內(nèi)通經(jīng)絡(luò)的功效，對(duì)風(fēng)濕痹痛、肢體麻木、陰疽腫毒及高脂血癥有治療作用。為控制該藥的內(nèi)在質(zhì)量，確保用藥安全有效，本試驗(yàn)中建立了方中大黃、山楂、王不留行等藥材的薄層色譜定性鑒別，以及大黃素含量的高效液相色譜測(cè)定方法，為痛風(fēng)利濕口服液質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠);硅膠G薄層板(煙臺(tái)大學(xué)生物科學(xué)與工程研究所);CS－15R型低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);電子天平(Sartorius公司);KQ－500E型醫(yī)用超聲波清洗器;高效液相色譜儀(HPLC125/166，美國(guó)Beckman公司)。大黃素對(duì)照品(批號(hào)為0756－9707)、熊果酸對(duì)照品(批號(hào)為110742－200313)、王不留行對(duì)照藥材(批號(hào)為1094－200001)，均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;其他試劑均為分析純;痛風(fēng)利濕口服液(自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[1]

大黃[2]:取本品 20 mL，加鹽酸 1.5 mL，回流提取 30 min，加乙醚萃取3次，每次10 mL，分取乙醚液，水洗2次，每次10 mL，合并乙醚液，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。再取缺大黃樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另精密稱取大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液色譜中則無(wú)此斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1 A。

山楂[3]:取本品20 mL，加硅藻土10 g，混勻后加乙醚20 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取缺山楂的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。精密稱取熊果酸對(duì)照品，加無(wú)水乙醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－三氯甲烷－乙酸乙酯(20∶5∶8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于110℃加熱10 min。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液色譜中則無(wú)此斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1 B。

王不留行[4]:取本品10 mL，加甲醇10 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。取缺王不留行的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。精密稱取王不留行對(duì)照藥材2 g，磨成粉末，加甲醇20 mL，回流30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照品溶液。吸取上述溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(15∶7∶2)的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀溶液顯色。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照品溶液色譜中則無(wú)此斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1 C。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －0.1%磷酸(85 ∶15);流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。

2.2.2 溶液制備

精密稱取干燥至恒重的大黃素對(duì)照品6 mg，加無(wú)水乙醇－乙酸乙酯(2∶1)使溶解，定容至100 mL，作為對(duì)照品溶液。精密吸取10 mL樣品，加鹽酸 1 mL，置水浴上加熱回流30 min，冷卻后，用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，取三氯甲烷層液合并，水洗2次，蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇－乙酸乙酯(2∶1)溶解，定容為10 mL，低溫離心(13000轉(zhuǎn)/min)5 min，取上清液作為供試品溶液。按處方組成，取缺大黃以外的其余藥材，按制備工藝要求制成不含大黃的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

空白干擾試驗(yàn):取2.2.2 項(xiàng)下 3 種溶液，按擬訂的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相同的色譜峰(見(jiàn)圖2)，處方中其他藥材對(duì)大黃素的測(cè)定無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液 2，4，6，8，10 mL，用甲醇 10 mL定容，取上述對(duì)照品溶液各20 μL，按擬訂的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)得的大黃素峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸得 A=0.8258C+6.1164(r=0.9997)，結(jié)果表明大黃素質(zhì)量濃度在12 ～60.0 μg/mL 范 圍 內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):分別精密吸取質(zhì)量濃度為48.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果的 RSD=0.9%，表明儀器精密度良好。

圖2 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)的樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果的 RSD為3%(n=5)，表明方法重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液 20 μL，分別于 1，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD=3%(n=6)，表明供試品溶液中大黃素在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密吸取已知含量的樣品(含量為1.7251μg/mL)3 份，每份 10 mL，分別加入 15，30，45 μg/mL 3 種質(zhì)量濃度的大黃素對(duì)照品溶液各1 mL，按供試品溶液制備方法平行操作3次，定容至10 mL。分別精密吸取3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液1 mL，各用甲醇定容至10 mL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大黃素加樣回收試驗(yàn)(n=9)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

按擬訂的方法，測(cè)定3批樣品溶液中大黃素制的含量。結(jié)果見(jiàn)表2，痛風(fēng)利濕口服液樣品中大黃素含量不低于 1.7 μg/mL。

3 討論

用薄層色譜法鑒別痛風(fēng)利濕口服液中的大黃時(shí)，筆者曾采用超聲方法直接提取大黃素，結(jié)果斑點(diǎn)不明顯，后改作用回流提取，結(jié)果斑點(diǎn)較清晰。

對(duì)照品溶液紫外光譜掃描測(cè)定，結(jié)果供試品溶液在254 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)吸收峰，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

曾使用甲醇－0.1%磷酸水溶液的比例為80∶20，此流動(dòng)相時(shí)要檢測(cè)的大黃素出峰時(shí)間靠后，調(diào)整比例為85∶15后，出峰時(shí)間在13～14 min之間，可節(jié)約有效時(shí)間。而再增大甲醇的比例，則大黃素峰與前一個(gè)峰分開(kāi)不明顯，不利于檢測(cè)，故流動(dòng)相甲醇－0.1%磷酸水溶液的最佳比例為85∶15。

在供試品液的制備中，開(kāi)始使用加入甲醇后超聲提取，蒸干后用甲醇溶解，離心后作供試品溶液。此方法雜質(zhì)干擾峰太多，且分離效果不理想，后改作加少量鹽酸回流提取，用三氯甲烷萃取，再用水洗，回收濾液，蒸干后用乙醇－乙酸乙酯(2∶1)溶解，圖譜比較理想，且分離效果顯著，鋒形相對(duì)尖銳。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:17，22，36，102，301，328，329，330，336，500，附錄 31.

[2]康廷國(guó)，瞿延君，蓋 峰.中成藥薄層色譜鑒別[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1995:423.

[3]徐國(guó)鈞，何宏賢，徐珞珊，等.中國(guó)藥材學(xué)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥出版社，1996:134，1051，1212.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典高效液相色譜圖集(第一卷)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:33，35.