陳桂林，樂智勇，盧錕剛，姜淋潔，方念伯，余尚工

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065)

絞股藍(lán) Gynostemma pentaphyllum(Thrunb.)Mak(GP)為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物，始見于1525年(明嘉靖四年)朱棣《救荒本草》，全草入藥，味苦、性甘寒、無毒，具有清熱解毒、補(bǔ)氣生津、祛痰止咳、安神固精的作用[1]。現(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明[2]，絞股藍(lán)主要藥效成分為絞股藍(lán)皂苷，具有降低血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)、極低密度脂蛋白(VLDLC)，增加高密度脂蛋白膽固醇(HDL－C)，抗動(dòng)脈粥樣硬化(AS)作用等[3－4]。其調(diào)脂作用與抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)生游離脂肪酸及合成中性脂肪有關(guān)[5]，臨床主要用于調(diào)節(jié)血脂代謝和抗AS。國(guó)內(nèi)外廣大學(xué)者對(duì)絞股藍(lán)調(diào)血脂及抗氧化作用進(jìn)行了大量研究，但多在總皂苷層面[3，6]，對(duì)有效藥用部位的研究較少。本試驗(yàn)旨在研究絞股藍(lán)的50%乙醇部位調(diào)血脂及抗氧化作用，為指導(dǎo)絞股藍(lán)的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

上海亞榮RE－6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、長(zhǎng)沙湘平ES－500HA型動(dòng)物稱重天平、長(zhǎng)沙平凡TG16－WS型臺(tái)式高速離心機(jī)、菲恰爾TGC－16B型離心機(jī)，深圳雷杜RT－9600型半自動(dòng)生化分析儀。SPF級(jí)雄性昆明小鼠，每只18～22 g，購(gòu)自武漢生物制品研究所，許可證號(hào)為SCXK(鄂)2008－0003;飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%。高脂飼料由實(shí)驗(yàn)室按照如下方式配置:基礎(chǔ)飼料78.8%，蛋黃粉10%，豬油10%，膽固醇1%，膽酸鈉0.2%，拌勻，加水適量制成高脂飼料，烘干備用[7]。絞股藍(lán)(批號(hào)為10111206，購(gòu)自咸寧康進(jìn)中藥飲片有限責(zé)任公司)，辛伐他汀片(商品名舒降之，規(guī)格為20 mg/片×7片/盒，批號(hào)為100239，杭州默沙東制藥有限公司)?？偰懝檀紲y(cè)定試劑盒(TC)、甘油三脂測(cè)定試劑盒(TG)、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒(HDL－C)均由上海名典生物工程有限公司提供;丙二醛測(cè)定試劑盒(MDA)、超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(SOD)均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 提取

取絞股藍(lán)，依次加10倍、10倍、8倍、8倍量水，沸后煎煮2 h，合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥后得黃棕色凍干粉總提物。將凍干粉用50%乙醇回流提取3次，過濾并合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥得到50%醇提部位凍干粉。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

SPF級(jí)雄性昆明小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體重隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、高脂對(duì)照組、陽性對(duì)照組、絞股藍(lán)50%乙醇部位組，每組10只。除正常對(duì)照組給予普通飼料外，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，測(cè)定空腹血脂水平，確認(rèn)血脂癥模型成功。正常對(duì)照組和高脂對(duì)照組以雙蒸水灌胃，陽性對(duì)照組灌胃舒降之6.7 mg/(kg·d)，絞股藍(lán)50%乙醇部位[相當(dāng)于生藥材5.44 g/(kg·d)]0.34 g/(kg·d)灌胃，連續(xù)給藥 30 d。

1.4 生化指標(biāo)

灌胃結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，然后眼球取血，離心分離血清;解剖采集肝、腎、脾等臟器稱重，每塊肝切下小片用生理鹽水沖洗，再用濾紙吸干后，投入10%福爾馬林液中固定作光鏡檢測(cè)用。血清及各臟器于－80℃冰箱保存，備用。將小鼠血清按照各試劑盒說明書規(guī)范操作，使用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC，TG，HDL－C，SOD，MDA等生化指標(biāo)，并根據(jù)公式計(jì)算出LDL－C，HDL－C/TC比值和動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)值，(LDL－C)=TC－(HDL－C)－TG/2.2(mmol·L)，AI=[TC－(HDL－C)]/HDL－C。試驗(yàn)期間各組小鼠每天喂等量飼料，試驗(yàn)結(jié)束前對(duì)小鼠進(jìn)行最后一次稱重，解剖后稱量肝、腎、脾臟器質(zhì)量，按照公式臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體重(g)×100%，得出小鼠肝臟、腎臟及脾臟指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差齊性、單因素方差分析(one－way－ANOVA)，組間比較用LSD法，試驗(yàn)結(jié)果均以表示，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)高脂血癥小鼠體重及各臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組大鼠的體重、肝指數(shù)顯著升高(P＜0.05);與模型組比較，絞股藍(lán)50%乙醇部位能顯著降低高脂模型的體重及肝指數(shù)(P＜0.05)，但對(duì)高脂模型小鼠的腎指數(shù)和脾指數(shù)均無顯著性影響(P＞0.05)。結(jié)果見表1，對(duì)臟器系數(shù)趨勢(shì)影響見圖1。

表1 對(duì)高脂血癥小鼠體重及各臟器指數(shù)的影響(n=10，)

表1 對(duì)高脂血癥小鼠體重及各臟器指數(shù)的影響(n=10，)

注:與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01，下表同。

組別空白組模型組陽性組50%乙醇組體重(g)41.18 ± 1.64△43.32 ± 3.6040.48 ± 1.26△40.19 ± 2.41△肝指數(shù)(%)4.05 ± 0.39▲5.22 ± 0.564.22 ± 0.24▲4.67 ± 0.35△腎指數(shù)(%)1.31 ± 0.121.24 ± 0.201.35 ± 0.08△1.30 ± 0.09脾指數(shù)(%)0.39 ± 0.060.32 ± 0.130.30 ± 0.050.37 ± 0.08

圖1 不同給藥組對(duì)小鼠肝、腎、脾系數(shù)的影響

2.2 對(duì)高脂血癥小鼠血脂的影響

與空白組相比，模型組的TC，TG，LDL－C顯著升高，HDLC顯著降低(P＜0.01)，說明模型建立成功。與模型組相比，絞股藍(lán)50%乙醇部位組小鼠的 TC，TG，LDL－C顯著降低，HDL－C有顯著升高(P＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響(mmol/L，n=10，)

表2 對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響(mmol/L，n=10，)

組別空白組模型組陽性組50%乙醇組TC 3.87 ± 0.17▲9.30 ± 1.414.69 ± 0.87▲5.85 ± 0.58▲TG 0.67 ± 0.06▲1.21 ± 0.120.69 ± 0.09▲0.98 ± 0.06▲HDL－C 3.31 ± 0.14△2.63 ± 0.463.50 ± 0.32▲3.47 ± 0.55▲LDL－C 0.25 ± 0.06▲6.12 ± 1.250.88 ± 0.10▲2.01 ± 0.91▲

2.3 對(duì)高脂血癥小鼠動(dòng)脈硬化指數(shù)及抗氧化能力的影響

與空白組比較，模型組的HDL－C/TC比值、SOD顯著降低，而AI和MDA顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，絞股藍(lán)50%乙醇部位能顯著降低MDA和AI，顯著升高SOD和HDL－C/TC比值(P ＜0.05或 P ＜0.01)。結(jié)果見表 3。

表3 對(duì)高脂血癥小鼠動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)及抗氧化能力的影響(n=10，)

表3 對(duì)高脂血癥小鼠動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)及抗氧化能力的影響(n=10，)

組別空白組模型組陽性組50%乙醇組SOD(U/mL)125.71 ± 7.68▲84.16 ± 5.05120.13 ± 7.80▲104.03 ± 5.91▲MDA(nmol/mL)13.72 ± 1.73▲18.25 ± 1.4013.21 ± 1.57▲16.22 ± 2.15△HDL－C/TC 0.85 ±0.07▲0.28 ± 0.030.75 ±0.06▲0.59 ± 0.12▲AI 0.17 ±0.03▲2.53 ±0.630.34 ±0.05▲0.76 ±0.34▲

2.4 對(duì)高脂血癥小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，肉眼觀察各組肝臟結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):正常組肝臟體積較小，顏色鮮紅，被膜光滑，切面光潔;模型組肝臟均呈現(xiàn)不同程度的脂肪浸潤(rùn)(大部分肝臟外觀呈現(xiàn)黃白色，切面油膩)，且較正常小鼠的肝臟肥大;陽性組及50%乙醇部位給藥組的肝臟形態(tài)均不同程度地接近正常組。病理切片顯示，正常組肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)清析，肝細(xì)胞正常，無腫脹和脂肪變性、壞死，無炎細(xì)胞浸潤(rùn)，胞漿內(nèi)未見脂滴;模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞體積明顯腫大以及嚴(yán)重脂肪變性，局部區(qū)域細(xì)胞發(fā)生灶狀壞死，脂肪空泡占據(jù)大部分胞漿，肝細(xì)胞核被脂滴擠向細(xì)胞一側(cè)，胞漿脂滴大量出現(xiàn)且嚴(yán)重聚積;陽性組與模型組相比肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，脂肪空泡明顯減少;與模型組相比，50%乙醇部位組肝細(xì)胞的脂肪體積均有不同程度的減少，肝細(xì)胞也有不同程度的恢復(fù);但肝細(xì)胞輕度大泡性脂肪病變，呈帶狀分布，偶見點(diǎn)狀壞死。

3 討論

血脂代謝紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化主要病因，可導(dǎo)致心腦血管疾病。高脂血癥中醫(yī)通常以痰濁、血瘀辨證論治。試驗(yàn)用絞股藍(lán)味苦、微甘，性寒，具有清熱解毒、祛除痰濁的功效[8]，從中醫(yī)理論上講可用于防治高脂血癥。迄今發(fā)現(xiàn)的絞股藍(lán)皂苷已達(dá)136種[9]。藥理研究證明，絞股藍(lán)含有83種與人參皂苷有類似骨架的達(dá)瑪烷型皂苷，有抗炎、降低膽固醇、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物活性和藥理作用，具有降低TC，TG，LDL－C和升高HDL－C功效。絞股藍(lán)通過調(diào)節(jié)脂肪代謝有減肥作用，無瀉下副作用，不影響食欲[10]。大量臨床資料證實(shí)其調(diào)脂功效[11－13]，但對(duì)其發(fā)揮調(diào)血脂和抗氧化作用的有效部位研究較少。本研究通過高脂飼料建立高脂血癥小鼠模型，觀察絞股藍(lán)50%乙醇部位調(diào)血脂和抗氧化作用，為絞股藍(lán)的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

高脂飲食可以導(dǎo)致高脂血癥和肝臟脂代謝紊亂[14]。高脂飼料喂養(yǎng)30 d后，模型組血脂水平TC、TG、LDL－C顯著性上升，HDL－C顯著降低，表明高脂血癥模型復(fù)制成功。在每天喂養(yǎng)高脂飼料并同時(shí)給藥30 d后，絞股藍(lán)50%乙醇部位給藥組能明顯降低高脂血癥小鼠的體重，明顯降低高脂血癥小鼠TC，TG，LDL－C的含量，提高HDL－C水平，表明絞股藍(lán)50%乙醇部位對(duì)高脂血癥有較好的治療作用。

脂類代謝與心血管疾病密切相關(guān)，高血脂則是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的主要原因之一，特別是TC及LDL－C水平增高是危險(xiǎn)指標(biāo)。血脂濃度的高低除機(jī)體代謝，特別是內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控外，外源性物質(zhì)的影響也是很重要的一個(gè)方面;研究表明HDLC的升高可抗阻動(dòng)脈粥樣硬化的形成，因此可改善脂質(zhì)代謝。臨床上以降低LDL－C和升高HDL－C水平為治療高脂血癥的主要目標(biāo)。MDA的含量常常可反映機(jī)體內(nèi)過氧化的程度，間接地反映出血管老化的程度;在生理狀態(tài)下，人體也有自由基的產(chǎn)生，但體內(nèi)存在的抗氧化酶系統(tǒng)能清除之，不致于引起組織細(xì)胞出現(xiàn)過氧化導(dǎo)致?lián)p傷，SOD是抗氧化酶系統(tǒng)的主要代表，它是自由基的清除劑，可抑制黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，從而抑制過氧化脂質(zhì)反應(yīng)，減少自由基和MDA的產(chǎn)生[15]。絞股藍(lán)50%乙醇部位給藥組給藥30 d后能顯著降低高脂血癥小鼠TC，TG，LDLC的含量，提高HDL－C水平，并能明顯提高SOD活力和降低MDA含量，提示該藥具有預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和抗氧化的作用。絞股藍(lán)和辛伐他汀一樣具有一定治療高膽固醇餌料飼養(yǎng)導(dǎo)致的血脂升高、預(yù)防動(dòng)物發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的作用[16]，說明絞股藍(lán)調(diào)節(jié)血脂代謝和抑制動(dòng)脈粥樣硬化的療效得到進(jìn)一步驗(yàn)證，為開發(fā)新的調(diào)脂藥提供依據(jù)。

由上可知，絞股藍(lán)50%乙醇部位部位有較好的調(diào)血脂及抗氧化作用。同時(shí)，本試驗(yàn)室還將對(duì)其相關(guān)成分深入研究，進(jìn)一步為指導(dǎo)臨床提供依據(jù)。

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