王斌斌，劉逸寒，李 玉，王建玲，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué)) 工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457)

β-葡萄糖苷酶(beta-Glucosedase，EC 3.2.1.21)是纖維素降解酶系的主要組分之一，它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[1]，在人類、動(dòng)物、植物和微生物的糖類代謝方面都具有重要的價(jià)值[2]。目前，β-葡萄糖苷酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、釀酒、醫(yī)藥、化工及糧食加工等領(lǐng)域，可用于改善茶葉、果汁的風(fēng)味[3]，生產(chǎn)低聚龍膽糖[1]、大豆異黃酮活性苷元[4]和天然抗氧化劑多酚化合物[5]等。

雖然植物中廣泛存在著β-葡萄糖苷酶，但其含量少、活力低、大規(guī)模生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶純化工藝較為復(fù)雜，限制了其擴(kuò)大應(yīng)用。因此，通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建工程菌，分泌表達(dá)高活性β-葡萄糖苷酶對(duì)其實(shí)現(xiàn)工業(yè)化具有重要意義。Raynal等[6]于1984年從脆壁克魯維酵母中克隆得到β-葡萄糖苷酶基因，并在大腸桿菌和釀酒酵母中表達(dá)，重組菌產(chǎn)酶活力分別達(dá)到570 U·mL-1和3660 U·mL-1。2007年Hong等[7]在畢赤酵母中對(duì)嗜熱子囊菌β-葡萄糖苷酶進(jìn)行表達(dá)，酶活力為0.7 U·mL-1。2009年李麗娟[8]實(shí)現(xiàn)黑曲霉GS115β-葡萄糖苷酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，酶活達(dá)到1218 U·mL-1，是出發(fā)菌株的33.6倍。迄今為止，已有多種微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶基因被克隆獲得并實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)及分泌，但β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌的相關(guān)研究絕大部分集中于真菌[9]，而對(duì)于細(xì)菌β-葡萄糖苷酶鮮有研究。隨著β-葡萄糖苷酶在化工以及其它領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌β-葡萄糖苷酶的優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯出來(lái)[10，11]，堿性和高溫的極端環(huán)境下真菌來(lái)源的酸性β-葡萄糖苷酶活力會(huì)急劇下降甚至喪失，而大多數(shù)細(xì)菌β-葡萄糖苷酶耐堿耐熱性能良好。因此，對(duì)細(xì)菌β-葡萄糖苷酶的研究成為主要發(fā)展趨勢(shì)。

作者從濱海新區(qū)鹽堿地土壤中分離篩選得到一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的短小芽孢桿菌B-4，并成功實(shí)現(xiàn)其β-葡萄糖苷酶基因bglB在大腸桿菌中的表達(dá)，為下一步該酶的性質(zhì)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 土樣來(lái)源

土樣采自天津?yàn)I海新區(qū)鹽堿地。

1.2 質(zhì)粒與試劑

E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET-22b(+)，自行保存；克隆載體pUCm-T，TaKaRa公司。

Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、純化DNA片段的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，Takara公司；X-Gal、IPTG、T4連接酶、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，上海生物工程有限公司。引物合成及測(cè)序由上海Invitrogen生物公司完成。

1.3 培養(yǎng)基

菌種富集篩選培養(yǎng)基：蛋白胨 1%，牛肉膏 0.3%，NaCl 0.5%，纖維二糖 0.5%，納他霉素適量，pH值7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基[12]：梔子苷 1‰，谷氨酸鈉 1%，蛋白胨 0.5%，KH2PO41%，MgSO40.05%，瓊脂 2%，pH值7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：麩皮 4%，(NH4)2SO40.2%，KH2PO40.2%，CaCl20.04%，MgSO4·7H2O 0.04%，121 ℃滅菌20 min。

1.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶細(xì)菌的篩選

1.4.1 初篩

稱取1 g土樣加入到10 mL無(wú)菌水中，于80～90 ℃熱水浴中保溫10～15 min，37 ℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)，得到菌懸液；將菌懸液置于裝有菌種富集篩選培養(yǎng)基的三角瓶中于37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)2 d；梯度稀釋(10～106)[14]，涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，篩選單菌落周圍藍(lán)色水解圈顏色較深且與菌落直徑比值相對(duì)較大的菌落進(jìn)行復(fù)篩。

1.4.2 復(fù)篩

將經(jīng)初篩獲得的單菌落接種于裝有富集篩選培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 h，按1%的接種量接種于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h。用DNS法測(cè)定其酶活，篩選獲得β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株。

1.5 β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定

取0.5 mL粗酶液加入到1.5 mL緩沖溶液配制的0.5% PNPG溶液中，于50 ℃水浴15 min；加入1.5 mL DNS，沸水浴5 min；冷卻至室溫后用蒸餾水稀釋至20 mL，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其吸光值(OD540)。

酶活力單位定義為：每小時(shí)產(chǎn)生1 mg還原糖所需的酶量，用U·mL-1表示。

1.6 菌株16S rDNA序列的擴(kuò)增、測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。所測(cè)細(xì)菌16S rDNA序列同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)菌株的16S rDNA序列比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。

1.7 引物設(shè)計(jì)及目的片段的擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上已經(jīng)發(fā)表的短小芽孢桿菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因序列bglB(登錄號(hào)為YP_001488769.1)設(shè)計(jì)上游引物：5′-CGCGGATCCATGAGGAGGGCATTCAACATGAACAA-3′(下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn))，下游引物：5′-CCG-GAATTCTTATGCATCTAAATGATCACCATTTGTCG-3′(下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：10×Taq緩沖溶液5 μL，模板DNA 1 μL，濃度為10 μmol·L-1的引物各2 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)4 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，超純水35.7 μL，混勻。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.8 bglB基因的克隆及序列分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。篩選獲得含bglB基因陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序后在NCBI與已有β-葡萄糖苷酶序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.9 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-bglB的構(gòu)建

將上述測(cè)序正確的質(zhì)粒及提取的大腸桿菌表達(dá)載體pET-22b(+)分別用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4連接酶于16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子，分別用PCR和雙酶切法進(jìn)行鑒定，并挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序。再將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。

1.10 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分析鑒定

將構(gòu)建好的工程菌BL21/pET-bglB和對(duì)照菌BL21/pET-22b(+)分別接種于5 mL帶有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有30 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度為1 mmol·L-1)，20 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。16 h后，4000 r·min-1冷凍離心收集菌體，將菌體懸于pH值7.0的磷酸緩沖溶液中，冰浴超聲。超聲波功率為200 W，每超聲5 s間隔8 s，共70次。分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%)，檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。按1.5方法，對(duì)重組菌株的酶活力進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的分離

傳統(tǒng)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株篩選方法主要是在以纖維二糖為唯一碳源的平板上根據(jù)透明圈的大小進(jìn)行篩選，由于纖維二糖價(jià)格較為昂貴，進(jìn)行較大規(guī)模篩選成本較高。因梔子苷可被β-葡萄糖苷酶分解生成梔子苷元，而梔子苷元可與谷氨酸鈉作用形成藍(lán)色化合物，故可根據(jù)產(chǎn)生的藍(lán)色圈來(lái)篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。本實(shí)驗(yàn)利用梔子苷篩選培養(yǎng)基獲得9株具有較高β-葡萄糖苷酶活力的菌株，見(jiàn)表1。

表1 9株具有較高β-葡萄糖苷酶活性的菌株

由表1可以看出，菌株B-4經(jīng)37 ℃培養(yǎng)后藍(lán)色圈直徑與菌落直徑的比值最大，且顏色最深，同時(shí)其經(jīng)進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)后具有最高的酶活，所以選用B-4作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)出發(fā)菌株。

2.2 菌株B-4的形態(tài)(圖1)、16S rDNA鑒定

圖1 B-4的菌落形態(tài)(a)和菌體形態(tài)(b)

由圖1可以看出，菌落較小，呈乳白色，表面光滑，不透明；菌體呈短桿狀，很少成鏈，大小為(0.6～0.7)μm×(2.0～3.0)μm，具內(nèi)生芽孢，少有兩端生，為革蘭氏陽(yáng)性菌。推測(cè)菌株B-4屬于芽孢桿菌。

利用NCBI中的BLAST軟件對(duì)B-4菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，菌株B-4與短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)的同源性為99%。又根據(jù)同源序列搜索，并且下載一些相關(guān)菌種的16S rDNA序列，利用MEGA 4.0軟件來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步探索菌株B-4與短小芽孢桿菌的親緣關(guān)系，見(jiàn)圖2。

圖2 菌株B-4 16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

由圖2可以看出，菌株B-4與Bacilluspumilus處于同一分支，進(jìn)化距離最短，這與BLAST比對(duì)的結(jié)果一致。

根據(jù)形態(tài)學(xué)、16S rDNA比對(duì)分析，可將菌株B-4鑒定為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。

2.3 短小芽孢桿菌B-4 β-葡萄糖苷酶基因bglB的獲得

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖如圖3所示。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn) 2.PCR產(chǎn)物

由圖3可以看出，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增后，得到1.5 kb左右的產(chǎn)物，片段大小與目的基因bglB相符。

2.4 bglB基因的序列測(cè)定與分析

按照1.8方法進(jìn)行bglB的擴(kuò)增、連接、驗(yàn)證和測(cè)序，其驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖4。

M.分子量標(biāo)記 1～5.pUCm-T-bglB/Bam HI+Eco RI

序列分析結(jié)果表明，所得目的基因片段大小為1437 bp，可編碼478個(gè)氨基酸，目的蛋白大小預(yù)計(jì)為52.5 kD。將該基因的核苷酸序列與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與短小芽孢桿菌SAFR-032及枯草芽孢桿菌TU-B-10編碼的β-葡萄糖苷酶基因(YP_001488769.1、YP_004879524.1)具有較高的同源性，達(dá)到97%，其中與短小芽孢桿菌SAFR-032編碼基因相比，41個(gè)堿基不同，翻譯為蛋白質(zhì)后有6個(gè)氨基酸差異，氨基酸同源性達(dá)到99%。

2.5 重組菌株BL21/pET-bglB的篩選與鑒定

按照1.9方法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-bglB,其雙酶切驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖5。

M.分子量標(biāo)記 1～4.pET-bglB/Bam HI+Eco RI

由圖5可以看出，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI及EcoRI雙酶切后，獲得的兩個(gè)特異性條帶大小分別與目的片段bglB及載體pET-22b(+)相符，表明重組菌株BL21/pET-bglB構(gòu)建成功。

2.6 SDS-PAGE檢測(cè)

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以BL21/pET-22b(+)誘導(dǎo)、BL21/pET-bglB未誘導(dǎo)作為對(duì)照。分別對(duì)超聲破碎后的上清液、沉淀和全菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。

M.分子量標(biāo)記 1.BL21/pET-bglB未誘導(dǎo)全菌體 2.BL21/pET-22b(+)誘導(dǎo)后全菌體 3.BL21/pET-bglB誘導(dǎo)后上清 4.BL21/pET-bglB誘導(dǎo)后沉淀 5.BL21/pET-bglB誘導(dǎo)后全菌體

由圖6可以看出，BL21/pET-bglB的上清、沉淀與全菌體中均發(fā)現(xiàn)有相對(duì)分子質(zhì)量約為58 kD的表達(dá)蛋白(條帶3～5)，與理論值略有差異，這是由于pET-22b(+)質(zhì)粒本身分別帶有His標(biāo)簽序列，其編碼的蛋白與目的蛋白融合表達(dá)的結(jié)果。通過(guò)Band-scan軟件分析得到其表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的37.3%左右，經(jīng)超聲破碎后，蛋白仍有一部分以包涵體形式存在于沉淀中，上清中有部分蛋白表達(dá)。同時(shí)，按照1.5方法，測(cè)得BL21/pET-bglB超聲破碎上清液中β-葡萄糖苷酶BGL的酶活力可達(dá)46.85 U·mL-1。

2.7 討論

目前，由于由植物直接提取β-葡萄糖苷酶存在較多問(wèn)題，微生物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶受到廣泛重視。雖然微生物來(lái)源β-葡萄糖苷酶在許多催化性質(zhì)上都表現(xiàn)出一定的相似性，但與大部分真菌β-葡萄糖苷酶相比，細(xì)菌β-葡萄糖苷酶在最適pH值、等電點(diǎn)等方面均明顯不同，其在中性或堿性條件下具有更高的催化活性[16]。因此，從實(shí)際應(yīng)用方面考慮，有必要開(kāi)發(fā)熱穩(wěn)定性好、pH值作用范圍寬的β-葡萄糖苷酶。

3 結(jié)論

從鹽堿地土壤中分離得到一株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的短小芽孢桿菌B-4。其β-葡萄糖苷酶基因bglB大小為1437 bp，編碼478個(gè)氨基酸，與已報(bào)道短小芽孢桿菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因(YP_001488769.1)核苷酸序列同源性為97%、氨基酸序列同源性為99%。進(jìn)一步利用表達(dá)載體pET-22b(+)，實(shí)現(xiàn)了β-葡萄糖苷酶基因bglB在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達(dá)，活力達(dá)46.85 U·mL-1。為下一步酶學(xué)特性的分析及結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。

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