韓秋菊

(遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧 撫順 113001)

山楂為薔薇科植物山楂的成熟果實(shí)，為藥食兩用中藥，性微溫，味酸甘，具有消積食、健脾胃、行氣散淤等功效。山楂中含有30多種生物活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物是主要的活性成分[1～3]，提取山楂中黃酮類化合物是提高山楂利用率的新途徑。乙醇浸提法工藝簡(jiǎn)單、易于推廣，廣泛應(yīng)用于黃酮類化合物的提取。作者在此對(duì)乙醇浸提法提取山楂黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，擬為更充分地開(kāi)發(fā)利用山楂資源提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

山楂，產(chǎn)自遼寧營(yíng)口。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，無(wú)水乙醇。

UV757CRT型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；205-2A型低速離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電子精密天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；FW800型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.2 g，用少量乙醇溶解后，用50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇定容到100 mL，得到濃度為2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 mL該標(biāo)準(zhǔn)溶液，用50%乙醇定容到100 mL，得到濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL、1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL、13.0 mL、17.0 mL、23.0 mL置于100 mL容量瓶中，加5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))亞硝酸鈉溶液1.0 mL放置6 min，再加10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))硝酸鋁溶液1.0 mL放置6 min，最后加4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液10.0 mL，用50%乙醇定容，放置10 min。以50%乙醇為空白對(duì)照，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在508 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 山楂黃酮的提取

按以下步驟提取山楂黃酮：山楂→去核→烘干→粉碎→脫色→烘干→稱重→乙醇浸提→山楂黃酮。按下式計(jì)算黃酮類化合物提取率：

式中：x為樣品總黃酮濃度，mg·mL-1；V為定容體積，mL；10為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 提取工藝條件優(yōu)化

首先以提取率為考核指標(biāo)，固定其它條件不變，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別考察料液比(g∶mL，下同)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)提取率的影響；然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以確定最優(yōu)工藝條件。

1.2.4 黃酮類化合物的含量測(cè)定

這是表現(xiàn)芭蕉“風(fēng)雅的閑寂”的名句，歷來(lái)被看作最具有禪宗境界的一首俳句。古池乃是永恒的形象化，永恒即“靜”即“寂滅”。蛙乃大自然中的紛繁現(xiàn)象之一，是假象，是無(wú)常。躍入古池發(fā)出水聲后，一切復(fù)歸平靜。短暫的“動(dòng)”對(duì)照出生命的本體——寂滅。

采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法測(cè)定提取液中黃酮類化合物的含量[4]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)山楂黃酮提取率的影響

按不同的料液比加入80%乙醇溶液于40 ℃下提取4 h，考察料液比對(duì)山楂黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)提取率的影響

由圖2可看出，隨著料液比的減小(即溶劑量的增加)，山楂黃酮的提取率逐漸升高；當(dāng)料液比達(dá)到1∶50后，提取率趨于穩(wěn)定。因此，從降低費(fèi)用、節(jié)省能源等方面考慮，料液比選擇1∶50較為適宜。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂黃酮提取率的影響

按料液比1∶50加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在40 ℃下提取4 h，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

由圖3可看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，山楂黃酮的提取率逐漸升高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，提取率達(dá)到最高；繼續(xù)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，提取率反而下降。這是因?yàn)?，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低，提取不完全，導(dǎo)致提取率較低；乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，提取液中雜質(zhì)含量增多，也導(dǎo)致提取率下降。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇70%較為適宜。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)山楂黃酮提取率的影響

按料液比1∶50加入70%乙醇溶液，在40 ℃下提取不同時(shí)間，考察提取時(shí)間對(duì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

由圖4可看出，山楂黃酮的提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低；當(dāng)提取時(shí)間為6 h時(shí)，提取率達(dá)到最高。因此，提取時(shí)間選擇6 h較為適宜。

2.1.4 提取溫度對(duì)山楂黃酮提取率的影響

按料液比1∶50加入70%乙醇溶液，在不同溫度下提取6 h，考察提取溫度對(duì)山楂黃酮提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)提取率的影響

由圖5可看出，隨著提取溫度的升高，山楂黃酮的提取率先升高后降低；當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高。從熱力學(xué)角度分析，提取溫度越高越有利于黃酮類化合物的溶出，但提取溫度過(guò)高時(shí)雜質(zhì)易溶出，同時(shí)乙醇的揮發(fā)不利于黃酮類化合物的溶出，且高溫會(huì)破壞黃酮類化合物。因此，提取溫度選擇50 ℃較為適宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，其因素與水平見(jiàn)表1，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知，各因素對(duì)山楂黃酮提取率的影響大小依次為：D>B>A>C，即提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間。乙醇浸提法提取山楂黃酮的最佳工藝條件是A3B2C3D2，即料液比1∶60、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間7 h、提取溫度50 ℃。

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表3可知，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度對(duì)山楂黃酮提取率影響均顯著。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳工藝條件(料液比1∶60、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間7 h、提取溫度50 ℃)下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，提取率分別為2.69%、2.88%、2.84%，平均提取率為2.80%，說(shuō)明該提取工藝效果較好、穩(wěn)定可靠，適合于提取山楂黃酮。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定乙醇浸提法提取山楂黃酮的最佳工藝條件為：料液比1∶60(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間7 h、提取溫度50 ℃，在此條件下提取率達(dá)到2.80%，提取效果穩(wěn)定。

[1] 周巧霞，顧明，王文祥，等．不同方法提取的山楂葉總黃酮含量的測(cè)定[J]．蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2002，22(2)：164.

[2] 孫立立，謝鴻霞，孫敬勇，等．比色法測(cè)定山楂中總黃酮的含量[J]．中成藥，2001，23(10)：748-750.

[3] 劉北林，董繼生，倪小虎，等．山楂黃酮提取及降血脂研究[J]．食品科學(xué)，2007，28(5)：324-327.

[4] 郭亞鍵，范莉，王曉強(qiáng)，等．關(guān)于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測(cè)定總黃酮方法的探討[J].藥物分析雜志，2002，22(2)：97-99.