張燎原，洪欲強(qiáng)，陳 雙，胡開輝

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

乙偶姻(Acetoin， AC)又名3-羥基丁酮，廣泛存在于玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、麥芽、動物組織中，也是多種微生物糖代謝的中間產(chǎn)物[1]。因其具有令人愉快的奶油香味，主要用于奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生產(chǎn)，我國GB 2760-1986規(guī)定允許食用[2]。此外，乙偶姻還可以作為一種C4平臺化合物，廣泛應(yīng)用于眾多行業(yè)，2004年美國能源部將其列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺化合物之一[3]。

乙偶姻的合成方法有微生物法和化學(xué)法，與化學(xué)法相比，微生物法因原料可再生、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點而備受關(guān)注[4，5]。自然界中有許多微生物能夠合成乙偶姻，主要包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)以及乳球菌屬(Lactococcus)等[6～9]。其中芽孢桿菌屬因安全及產(chǎn)量高被學(xué)者們廣泛研究，如Bacillussubtilis、Bacilluslicheniformis、Paenibacilluspolymyxa等[10～12]，這些菌株雖然在產(chǎn)量上已獲得提高，但因成本高仍然難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。目前報道的乙偶姻生產(chǎn)菌基本都是以葡萄糖為碳源，因此，尋找更廉價的生產(chǎn)原料及篩選能高效利用這些廉價原料的菌株具有重要意義。

作者在此篩選到一株能利用木糖和葡萄糖作為雙底物產(chǎn)乙偶姻的多粘芽孢桿菌，并對該菌株產(chǎn)乙偶姻的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，以期獲得高產(chǎn)量的乙偶姻。

1 實驗

1.1 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基(g·L-1)：木糖 20，NaCl 0.5，MgSO40.5，(NH4)2SO42，KH2PO40.5，瓊脂粉20，pH 值7.0。

LB培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，pH 值7.0。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，(NH4)2SO46，KH2PO410，NaCl 0.5，MgSO40.5，pH 值7.0。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖40，木糖20，蛋白胨5，酵母粉10，KH2PO40.5，pH 值7.2。

1.2 菌株篩選

采集福建農(nóng)林大學(xué)中華植物園土壤。稱取1 g土壤溶于50 mL無菌水中，漩渦振蕩5 min，80 ℃水浴中靜置30 min以獲得菌株，梯度稀釋，涂布到固體篩選培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h，挑單菌落于種子培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h。保藏菌種，同時分別轉(zhuǎn)接至裝有20 mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、150 r·min-1下發(fā)酵24 h，取樣，通過VP(Voges-Proskauer)實驗定性分析單菌落是否產(chǎn)乙偶姻，對產(chǎn)乙偶姻的樣品采用氣相色譜進(jìn)行定量分析，確定乙偶姻產(chǎn)量最高的菌株。

1.3 菌株16S rDNA鑒定

將乙偶姻產(chǎn)量最高的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)12 h，離心收集菌體，采用基因組提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司)提取基因組DNA。

以基因組DNA為模板，采用通用引物(16S1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和16S2：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：模板DNA 2.0 μL，10×PCR buffer (含20 mmol·L-1MgCl2) 5 μL，DNA聚合酶(5 U·μL-1) 1.0 μL，dNTPs(10 mmol·L-1) 1.0 μL，引物(10 mmol·L-1)各2 μL，ddH2O 37.0 μL，總體積為50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后進(jìn)行商業(yè)測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，并結(jié)合生理生化特征鑒定菌株。

1.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)速為150 r·min-1的條件下，分別對培養(yǎng)溫度、pH值、裝液量和接種量(體積比，下同)進(jìn)行優(yōu)化(培養(yǎng)溫度分別控制在28 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃；培養(yǎng)基pH值分別控制在5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；裝液量分別為在250 mL三角瓶中裝10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL；接種量分別控制在1%、3%、5%、7%、9%)，發(fā)酵時間為24 h，取樣離心，取上清液-20 ℃保存待測。

1.5 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

綜合已報道對乙偶姻生物合成影響較大的培養(yǎng)基組分，選擇葡萄糖-木糖(2∶1，質(zhì)量比)、蛋白胨、酵母粉、MnSO4、FeSO4、KH2PO4和乙酸鈉等7個組分進(jìn)行PB(Plackett-Burman)實驗，從中篩選對乙偶姻合成具有顯著影響的組分，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法(RSM)確定具有顯著影響組分的最佳濃度，培養(yǎng)基組分優(yōu)化發(fā)酵時間為48 h。

1.6 分析與檢測

菌體濃度：以發(fā)酵液在600 nm波長下的吸光度OD600來表征。

發(fā)酵液中葡萄糖和木糖濃度：取上清液適度稀釋，采用葡萄糖檢測試劑盒(上海捷門生物技術(shù)公司)檢測葡萄糖濃度，采用地衣酚法測定木糖濃度[13]。

乙偶姻濃度：采用Aglient GC9860型氣相色譜儀測定。色譜柱采用毛細(xì)管柱DB-5，采用FID氫火焰檢測器，氮氣作為載氣，流速為1 mL·min-1，柱溫為50 ℃保留1.5 min，然后25 ℃·min-1程序升溫到180 ℃保留10 min，進(jìn)樣口溫度為215 ℃，檢測器溫度為245 ℃。上清液用乙酸乙酯萃取，進(jìn)樣，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算乙偶姻濃度[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選

固體篩選培養(yǎng)基平板中長出15個單菌落，挑取單菌落接種至初始發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，經(jīng)VP實驗驗證共有10株菌呈陽性，表明從土壤中篩選到10株產(chǎn)乙偶姻的菌株。采用氣相色譜對10株乙偶姻產(chǎn)生菌進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙偶姻產(chǎn)生菌產(chǎn)乙偶姻比較

從圖1可以看出,菌株5#乙偶姻產(chǎn)量最高，為9.69 g·L-1。因此，采用該菌株進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分優(yōu)化研究。

2.2 16S rDNA分子鑒定(圖2)

圖2 5#菌株的16S rDNA分子鑒定

從圖2可以看出，5#菌株經(jīng)通用引物擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，在約1500 bp的位置出現(xiàn)了清晰的條帶。切膠回收進(jìn)行商業(yè)測序，測序結(jié)果顯示該條帶大小為1461 bp，提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast序列比對，與多粘芽孢桿菌同源性為99%，結(jié)合菌落形態(tài)和生理生化特征鑒定，確定5#菌株為多粘芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)，命名為LY107。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

通過單因素實驗分別考察培養(yǎng)溫度、pH值、裝液量和接種量對LY107產(chǎn)乙偶姻的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 LY107發(fā)酵條件單因素實驗優(yōu)化

從圖3可以看出,培養(yǎng)溫度和pH值對菌株LY107產(chǎn)乙偶姻有顯著的影響，培養(yǎng)溫度為37 ℃、pH值為7.0時的乙偶姻產(chǎn)量最高，因此確定LY107產(chǎn)乙偶姻的最適培養(yǎng)溫度和pH值分別為37 ℃和7.0；裝液量和接種量對LY107產(chǎn)乙偶姻的影響相對較小，其中裝液量的影響主要在于影響氧氣的供應(yīng)，氧氣供應(yīng)過多將導(dǎo)致糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸流向TCA循環(huán)，而氧氣供應(yīng)不足會使產(chǎn)生的乙偶姻進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為2,3-丁二醇，裝液量為15 mL時的乙偶姻產(chǎn)量最高，因此，確定最適裝液量為250 mL三角瓶中裝液15 mL；乙偶姻產(chǎn)量隨著接種量的增大而增加，但接種量達(dá)到5%后，乙偶姻的產(chǎn)量變化不大，因此，確定最適接種量為5%。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

PB實驗被用于篩選對乙偶姻產(chǎn)量具有顯著影響的因子，PB實驗設(shè)計見表1，結(jié)果見表2。

表1 PB設(shè)計篩選培養(yǎng)基組分

注：R2=90.75%

從表1的P值(P<0.05)可知，酵母粉和乙酸鈉對乙偶姻的合成具有顯著影響，酵母粉在氮源和微量元素的提供上有利于乙偶姻的合成，乙酸鈉被認(rèn)為是乙偶姻操縱子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的誘導(dǎo)劑；其次是碳源葡萄糖-木糖和蛋白胨；而從t值可知，MnSO4和FeSO4呈負(fù)效應(yīng)，其余組分都是正效應(yīng)，即促進(jìn)乙偶姻生成，因此，最終確定葡萄糖-木糖、蛋白胨和KH2PO4取高水平，MnSO4和FeSO4取低水平，而酵母粉和乙酸鈉的濃度則需要通過RSM進(jìn)一步確定。

表2 PB設(shè)計實驗結(jié)果

從表2可以看出，不同組分濃度的組合導(dǎo)致乙偶姻產(chǎn)量從9.4 g·L-1至19.1 g·L-1顯著變化，說明培養(yǎng)基組分對乙偶姻的合成有較大的影響。

根據(jù)PB設(shè)計分析結(jié)果，影響乙偶姻產(chǎn)量的2個重要影響因素為酵母粉和乙酸鈉。采用MINITAB15.0軟件中心復(fù)合方法，酵母粉和乙酸鈉(分別編號為X3、X7)的中心點分別取15 g·L-1和2 g·L-1，設(shè)計2因素5水平響應(yīng)面實驗，其余培養(yǎng)基組分(g·L-1)為：葡萄糖-木糖(2∶1)60，蛋白胨5，MnSO40.05，F(xiàn)eSO40.005 ，KH2PO40.1，實驗設(shè)計及結(jié)果見表3，響應(yīng)面模型分析見表4。

根據(jù)回歸方程，利用MINITAB15.0軟件繪制響應(yīng)面及其等高線，如圖4所示。

從圖4可以看出，兩因素之間交互作用不顯著，最佳點落在實驗考察的區(qū)域內(nèi)。

表3 中心復(fù)合實驗設(shè)計及實驗結(jié)果

表4 響應(yīng)面模型分析

通過MINITAB15.0軟件中“響應(yīng)優(yōu)化器”進(jìn)行尋優(yōu)，得到優(yōu)化結(jié)果為：酵母粉16.5 g·L-1、乙酸鈉2.47 g·L-1，乙偶姻的預(yù)測值為22.38 g·L-1。最終確定優(yōu)化培養(yǎng)基組分(g·L-1)為：葡萄糖-木糖60，蛋白胨5，酵母粉16.5，MnSO40.05，F(xiàn)eSO40.005，KH2PO40.1，乙酸鈉2.47。

圖4 響應(yīng)面曲面圖和等值線圖分析

2.5 驗證實驗

采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基組分在搖瓶中進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果如圖5所示。

圖5 多粘芽孢桿菌LY107產(chǎn)乙偶姻過程

從圖5可以看出，從生長來看，發(fā)酵過程中細(xì)胞經(jīng)歷短暫的延滯期后快速進(jìn)入對數(shù)期，24 h后菌體密度(OD600)達(dá)到最大值15.66；糖耗曲線表明多粘芽孢桿菌LY107首先利用速效碳源葡萄糖，在18 h葡萄糖快利用完時才開始利用木糖，說明發(fā)酵過程中存在葡萄糖效應(yīng)；采用優(yōu)化發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基的乙偶姻最高產(chǎn)量為23.9 g·L-1，與預(yù)測值22.38 g·L-1接近，葡萄糖-木糖轉(zhuǎn)化率為79.9%，基本驗證了模型的可靠性。

3 結(jié)論

篩選到一株可以利用木糖產(chǎn)乙偶姻的菌株，經(jīng)16S rDNA和生理生化鑒定為多粘芽孢桿菌，命名為LY107。以葡萄糖-木糖(2∶1，質(zhì)量比)為碳源模擬木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻，經(jīng)單因素實驗優(yōu)化培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、pH值7.0、裝液量為15 mL/250 mL、接種量5%(體積比)。經(jīng)Plackett-Burman實驗和RSM優(yōu)化培養(yǎng)基組分(g·L-1)為：葡萄糖-木糖60，蛋白胨5，酵母粉16.5，MnSO40.05，F(xiàn)eSO40.005，KH2PO40.1，乙酸鈉2.47。在優(yōu)化培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分下，乙偶姻的最高產(chǎn)量為23.9 g·L-1、葡萄糖-木糖轉(zhuǎn)化率為79.9%。

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