王玉鋒，鄧凡政

(淮北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000)

眾所周知，蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。血紅蛋白是動(dòng)物及人體內(nèi)執(zhí)行輸氧任務(wù)的蛋白質(zhì)，是生命機(jī)體進(jìn)行各種生理活動(dòng)的主要承擔(dān)者。銅是人體和動(dòng)物組織中必需的微量元素,主要功能是參與氧化還原反應(yīng)，生物分子中的銅與分子氧直接反應(yīng)產(chǎn)生自由基[1]。蛋白質(zhì)某些功能的喪失、激活和維持往往與金屬離子有著密切的關(guān)系。離子液體雙水相體系能夠?yàn)樯锘钚苑肿犹峁┫鄬?duì)溫和的環(huán)境而不易使其失活[2]。

作者在此以Cu(Ⅱ)和牛血紅蛋白(BHb)為研究對(duì)象，探討了兩者在親水性離子液體1-丁基-3-甲基溴代咪唑([Bmim]Br)和NaH2PO4·2H2O形成的雙水相體系中的相互作用，為生物化學(xué)、藥物化學(xué)等領(lǐng)域的研究提供理論和應(yīng)用信息。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

1×10-5mol·L-1BHb溶液，4 ℃保存；1×10-2mol·L-1Cu(Ⅱ)溶液；離子液體[Bmim]Br參照文獻(xiàn)[3]制備；pH值為7.40的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液，常規(guī)方法配制；固體NaH2PO4·2H2O。所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

FP-6500型熒光分光光度計(jì)，日本分光株式會(huì)社；UV-3600型紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì)，日本島津公司；PHS-3D型酸度計(jì)，上海虹益儀器儀表有限公司；XW-80A型漩渦混合器，江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠；超純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.2 方法

在10 mL刻度比色管中加入1.00 mL緩沖溶液、1.00 mLBHb溶液、不同量的Cu(Ⅱ)溶液和1.50 mL離子液體[Bmim]Br，加水定容至5 mL，再加入2.50 g固體NaH2PO4·2H2O，混勻，在一定溫度下作用15 min后,取上相于另一比色管中稀釋到所需刻度。

以水作參比,用1 cm比色皿測(cè)定紫外可見(jiàn)吸收光譜；在激發(fā)波長(zhǎng)為282 nm、發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為10 nm、掃描速率為1000 nm·min-1的條件下測(cè)定熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu(Ⅱ)與 BHb作用的熒光猝滅光譜(圖1)

cBHb=1.25×10-6mol·L-1 1～9，cCu(Ⅱ)(×10-4mol·L-1 )：0，1.25，2.50，3.75，6.25，7.50，8.75，10.00，11.25

由圖1可看出，BHb在290～530 nm范圍內(nèi)有2個(gè)發(fā)射峰，339 nm為色氨酸和酪氨酸殘基的熒光峰，432 nm可能是類(lèi)似原卟啉和BSA的熒光峰，反映了卟啉和結(jié)合蛋白分子的某種獨(dú)特的相互作用[4]。隨著Cu(Ⅱ)的加入，2個(gè)熒光發(fā)射峰的波長(zhǎng)變化不大，但蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，說(shuō)明兩者之間存在著相互作用，發(fā)生了熒光猝滅及能量轉(zhuǎn)移。

熒光猝滅過(guò)程通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用引起的，可以用Stern-Volmer方程來(lái)描述[5]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中：F、F0為有、無(wú)猝滅劑時(shí)BHb的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑Cu(Ⅱ)的濃度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

不同溫度下，Cu(Ⅱ)與BHb的Stern-Volmer曲線如圖2所示。

圖2 Cu(Ⅱ)與BHb的Stern-Volmer曲線

由圖2直線的斜率及截距求出不同溫度下作用的KSV等數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 Cu(Ⅱ)與BHb作用的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)

由表1可知，Kq值大于動(dòng)態(tài)猝滅的Kq值2.0×1010L·mol-1·s-1[6]，且KSV隨著溫度的升高有所降低,由此判斷Cu(Ⅱ)與BHb的熒光猝滅作用不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是Cu(Ⅱ)與BHb形成了基態(tài)復(fù)合物、對(duì)BHb內(nèi)源熒光的猝滅過(guò)程，應(yīng)為靜態(tài)猝滅。

2.2 Cu(Ⅱ)與 BHb作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合力類(lèi)型

對(duì)于靜態(tài)猝滅,蛋白質(zhì)等熒光體與猝滅劑分子之間的相互作用可用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程進(jìn)行描述[7]:

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(2)

繪制lg[(F0-F)/F]～lg[Q]曲線圖，并由圖計(jì)算結(jié)合常數(shù)Kb、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，溫度升高，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均減小，298 K和310 K下的結(jié)合常數(shù)分別為4.28×103L·mol-1和3.65×103L·mol-1、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.8887和0.8339，說(shuō)明生成的復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度的升高而降低，進(jìn)一步證明Cu(Ⅱ)與BHb的作用是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過(guò)程。

當(dāng)溫度變化不大時(shí)，結(jié)合反應(yīng)的焓變?chǔ)θ可看成一個(gè)常數(shù)，根據(jù)下列熱力學(xué)公式求得結(jié)合反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變?chǔ)θ、焓變?chǔ)θ和熵變?chǔ)θ，見(jiàn)表1。

(3)

ΔGθ=-RTlnK

(4)

ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ

(5)

Ross等[8]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)小分子與生物大分子作用的熱力學(xué)參數(shù)可以簡(jiǎn)單判斷其相互作用力類(lèi)型：即氫鍵或范德華力使體系的ΔHθ<0、Sθ<0，疏水作用力使體系的ΔHθ>0、Sθ>0，靜電作用力使體系的ΔHθ≈0、ΔSθ>0。由表1中相關(guān)數(shù)據(jù)得出在離子液體雙水相中，Cu(Ⅱ)與BHb分子間作用力主要是靜電作用力，且是一個(gè)放熱、熵增的自發(fā)過(guò)程。

2.3 Cu(Ⅱ)對(duì)BHb構(gòu)象的影響

同步熒光光譜已用于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析。Δλ=15 nm時(shí)僅表現(xiàn)為酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時(shí)則顯示色氨酸殘基的熒光[9]。Cu(Ⅱ)對(duì)BHb同步熒光的影響如圖3所示。

cBHb=1.25×10-6mol·L-1 1～6,cCu(Ⅱ)(×10-4mol·L-1 ):0,1.25，3.75，5.00，6.25，8.75

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)條件下，酪氨酸和色氨酸殘基熒光同時(shí)被猝滅，相比之下，色氨酸殘基的熒光降低比酪氨酸殘基更顯著，說(shuō)明Cu(Ⅱ)與BHb的結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸殘基。二者的最大發(fā)射波長(zhǎng)均未改變，說(shuō)明Cu(Ⅱ)雖然與BHb發(fā)生了作用，但并沒(méi)有改變蛋白質(zhì)疏水腔的疏水環(huán)境，對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象影響不大[10]。

2.4 Cu(Ⅱ)與 BHb作用的紫外可見(jiàn)吸收光譜(圖4)

1～5：離子液體下相中BHb，上相中Cu(Ⅱ)、離子液體、BHb、Cu(Ⅱ)與BHb

由圖4可知，在406 nm附近出現(xiàn)的吸收峰為Soret帶，這是氧合血紅蛋白中血紅素輔基與氨基酸殘基間的π-π*躍遷帶[11]；在測(cè)定波長(zhǎng)范圍，可以看出BHb幾乎完全被萃取到離子液體上相中；在406 nm附近單純Cu(Ⅱ)和離子液體上相的紫外吸光度均較小，而Cu(Ⅱ)的加入可使BHb的吸光度增大，表現(xiàn)為增色效應(yīng)，說(shuō)明在雙水相中Cu(Ⅱ)與BHb之間發(fā)生了相互作用。

3 結(jié)論

運(yùn)用熒光光譜、紫外可見(jiàn)吸收光譜獲得了Cu(Ⅱ)與BHb的作用信息，采用Stern-Volmer方程和雙倒數(shù)方程對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。結(jié)果表明，Cu(Ⅱ)與BHb產(chǎn)生了熒光猝滅作用，且屬于靜態(tài)猝滅過(guò)程；熱力學(xué)參數(shù)表明Cu(Ⅱ)與BHb之間的相互作用力類(lèi)型為靜電作用力；Cu(Ⅱ)與BHb在298 K和310 K下的結(jié)合常數(shù)分別為4.28×103L·mol-1和3.65×103L·mol-1、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.8887和0.8339。同步熒光光譜表明Cu(Ⅱ)雖然與BHb發(fā)生了作用，但沒(méi)有改變蛋白質(zhì)疏水腔的疏水環(huán)境，對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象影響不大。

[1] 劉璐,嚴(yán)玉仙.銅和致癌作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)(醫(yī)學(xué)地理分冊(cè))，2004,25(1):29-33.

[2] 李志勇,裴淵超,王鍵吉.離子液體與蛋白質(zhì)相互作用的熒光光譜研究[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010,38(1):100-104.

[3] Cull S G,Holbrey J D,Vargas-Mora V,et al.Room-temperature ionic liquids as replacements for organic solvents in multiphase bioprocess operations[J].Biotechnol Bioeng，2000,69(2):227-233.

[4] 左智穎,薄云紅,楊曉達(dá)，等.稀土對(duì)血紅蛋白載氧功能的抑制及與血紅蛋白的作用[J].中國(guó)稀土學(xué)報(bào)，1996,14(4):336-340.

[5] 馬貴斌,高飛,任斌知,等.熒光法研究藥物分子與人血清白蛋白的結(jié)合作用[J].化學(xué)學(xué)報(bào),1995,53(12):1193-1197.

[6] 陳國(guó)珍，黃賢智，鄭朱梓,等.熒光分析法(第二版)[M].北京：科學(xué)出版社，1990:231.

[7] 楊曼曼,楊頻,張立偉.熒光法研究咖啡酸類(lèi)藥物與白蛋白的作用[J].科學(xué)通報(bào),1994,39(1):31-35.

[8] Ross P D，Subramanian S.Thermodynamic of protein association reactions:Forces contributing to stability[J].Biochemistry，1981,20(11):3096-3102.

[9] Wang Y Q,Zhang H M，Zhang G C,et al.Binding of brucine to human serum albumin[J].Journal of Molecular Structure，2006,830(1-3):40-45.

[10] 常?？?黃艷,賀群.銥(Ⅳ)離子與人血丙種球蛋白的作用研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2005,63(3):223-228.

[11] Zhu Y C,Cheng G J,Dong S J.Structural electrochemical study of hemoglobin by in situ circular dichroism thin layer spectroelectrochemistry[J].Biophys Chem,2002,97(2-3)：129-138.