劉 莉 余可斐 穆敬平 黎瑞紅 孟忠吉 趙 磊

支氣管哮喘(bronchial asthma，BA)是由包括氣道炎性細胞等多種細胞和結(jié)構細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，是全球最常見的慢性疾病之一［1］。大量的實驗研究亦證明，支氣管哮喘不僅存在氣道炎癥，而且還發(fā)生氣道結(jié)構的改變，即氣道重塑［2］。哮喘的發(fā)病原因復雜，目前認為遺傳、環(huán)境，精神-心理等各種因素導致了氣道壁發(fā)生以Th2型免疫反應占優(yōu)勢的慢性炎癥，并引起氣道重塑。研究發(fā)現(xiàn)氣道重塑在哮喘的早期就已開始，并與炎癥相互作用，加劇病情。

哮喘會導致氣道高反應性，其機制與炎癥引起的氣道平滑肌收縮反應性增強和氣道結(jié)構重建有關。肥大細胞及IL-10等細胞因子參與了氣道炎癥所致的氣道高反應性的形成。

糖皮質(zhì)激素作為治療哮喘的一線用藥，主要是發(fā)揮其抗炎作用，也有報道糖皮質(zhì)激素可以部分抑制氣道重塑。但需要早期、長期使用，因此，存在使用的依存性及副作用的問題。本研究擬通過復制慢性哮喘大鼠模型，觀察地塞米松對哮喘動物模型氣道重塑和肺組織肥大細胞、IL-10的影響，探討地塞米松在氣道炎癥和氣道重塑中的作用機制，為臨床治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物:清潔級健康雄性SD大鼠30只，4～6周齡，體質(zhì)量(180±12)g，由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，合格證號:SYXX(鄂)2005-0008。動物實驗前一周適應性飼養(yǎng)于動物中心實驗動物房，平均溫度(25±2)℃，無卵蛋白飲食，每天12 h自然光光照/12 h無光照。

2.主要試劑:雞卵白蛋白 (ovalbumin，OVA，grade V)購自美 國 Sigma公司;IL-10購 自武漢博士德生物工程有限公司;鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(strept avidin-biotin complex，SABC)免疫組化檢測試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。甲苯胺藍購自美國Sigma公司。

二、實驗方法

1.實驗動物分組:將30只大鼠按隨機分為3組，每組10只，即對照組，哮喘組，地塞米松干預組。

2.哮喘模型建立:參照文獻［3-4］采用卵清蛋白注射和霧化制備大鼠哮喘模型。分別于第0、7、14天大鼠腹腔內(nèi)注射10% 卵蛋白和10%氫氧化鋁混合液1 ml進行致敏，從第15天開始為激發(fā)階段，將大鼠置于密閉玻璃罩中，用1%卵蛋白噴霧激發(fā)大鼠哮喘發(fā)作，隔日1次，每次20 min，共激發(fā)4 W。大鼠出現(xiàn)打噴嚏、呼吸加快、口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、點頭呼吸及二便失禁、站立不穩(wěn)等表現(xiàn)為激發(fā)成功。對照組以生理鹽水腹腔注射及霧化吸入。地塞米松干預組以上述同樣的方法進行致敏和激發(fā)，每次激發(fā)前1h分別予以腹腔注射地塞米松(0.5 mg/kg)治療。末次刺激后24h處死動物。

3.病理標本采取:動物頸椎脫臼處死，迅速打開胸腔，取出左支氣管、左肺投入10%中性福爾馬林溶液中固定24 h，取出后水漂洗，分別入70%、80%乙醇各一次，95%、無水乙醇各兩次，每次45 min，入二甲苯兩次，每次15 min，58℃ ～60℃ 浸蠟2 h后，肺標本嚴格于垂直位石蠟包埋，切片，片厚5 μm。并作常規(guī)蘇木精-伊紅(hemotoxylin and eosin，HE)染色、鏡下觀察。

4.肺組織氣道形態(tài)學指標分析:行HE染色后，光鏡觀察(觀察倍數(shù)10×40):每個切片采集5個完整的支氣管橫斷面，采用IPP6分析軟件分析圖像，測定支氣管基底膜周徑(Pbm)、管壁總面積(WAt)、內(nèi)壁面積(WAi)及平滑肌面積(WAm)，并用Pbm將測量值標準化，分別以WAt/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm代表相應管壁的厚度，以衡量氣道重構的程度。

5.肥大細胞染色:①組織塊固定于4%中性甲醛-生理鹽水或中性40%甲醛-乙醇中，常規(guī)脫水、石蠟包埋和切片;②切片脫蠟至水;③0.5%甲苯胺藍液染20～30 min;④稍水洗;⑤0.5%冰醋酸液分化，至細胞核和細胞質(zhì)顆粒清晰(在顯微鏡下控制);⑥稍水洗，吹干;⑦二甲苯透明，中性樹膠封固。染色結(jié)果:肥大細胞細胞質(zhì)顆粒呈紅紫色，胞核呈藍色。

6.免疫組織化學SABC法檢測IL-10在小鼠肺組織的表達水平:石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，經(jīng)微波處理，滴加比例為1︰100的IL-10-抗抗體，37℃孵育1 h;滴加二抗試劑盒中 A液(生物素化山羊抗小鼠 IgG)，37℃孵育20 min;用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)溶液顯色，室溫顯色，鏡下控制反應時間。自來水充分沖洗，蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片。

結(jié)果判斷:以細胞質(zhì)清晰棕色為陽性，采用圖像分析軟件Image-Pro plus 5.0對IL-10陽性部位進行原位定量檢測，每張切片隨機選用5個視野(10×40)，自動選取陽性部位并計算相對IOD值。

三、統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS for Windows 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料采用均數(shù)±標準差()表示，對數(shù)據(jù)作正態(tài)分布檢驗。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊時采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)比較組間差異性，方差不齊時用Games-Howell比較組間差異性，P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠霧化激發(fā)后行為改變

對照組行動敏捷，一般情況未見異常。哮喘組大鼠霧化吸入2.5%OVA后，10 min左右出現(xiàn)較明顯的頭面部、腹部痙攣，進而呼吸急促，易激惹，煩躁不安，弓背，前肢縮抬，點頭呼吸，重者可聞哮鳴音，可見皮膚紫紺，取出大鼠后可見遺留較多屎尿;地塞米松組大鼠也出現(xiàn)哮喘組情況，但癥狀明顯減輕。

二、各組大鼠肺組織病理學觀察

如圖1～3所示。光鏡下觀察，對照組大鼠支氣管黏膜黏膜上皮、黏膜肌層完好，黏膜皺褶多而小，氣管及各級支氣管僅見散在的杯狀細胞，未見腺體管增生及明顯炎性細胞浸潤，管周圍組織亦無炎性細胞浸潤;哮喘組大鼠氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，黏膜下水腫，黏膜下層增寬，管腔狹窄，可見黏液栓堵塞，氣道上皮細胞脫落，杯狀細胞增多，伴黏液高分泌，膠原過度沉積，黏膜下及管周有大量炎性細胞浸潤，可見淋巴濾泡。地塞米松組表現(xiàn)為支氣管及血管周圍少量炎癥細胞浸潤，黏膜上皮輕度破損，與哮喘組相比較，上述改變明顯減輕，黏膜皺褶較小，平滑肌細胞及杯狀細胞增生不明顯。

圖1 正常組(HE 400×)

圖2 模型組(HE 400×)

圖3 治療組(HE 400×)

三、肺組織氣道形態(tài)學測定

1.WAt/Pbm:三組相互比較氣道平滑肌厚度有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。哮喘組與正常對照組相比較，氣道壁顯著增厚(P＜0.01)，地塞米松組氣道壁厚度明顯低于模型組，與對照組相比有明顯差別(P＞0.05)，地塞米松組與正常對照組比較，氣道壁厚度無明顯差別(P＞0.05)。

2.WAi/Pbm:三組相互比較氣道平滑肌厚度無明顯差別(P＞0.05)。

3.WAm/Pbm:三組相互比較氣道平滑肌厚度有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。哮喘組與正常對照組相比較，氣道壁顯著增厚(P＜0.01)，地塞米松組氣道壁厚度明顯低于哮喘組，與對照組相比有明顯差別(P＞0.05)，地塞米松組與正常對照組比較，氣道壁厚度無明顯差別(P＞0.05)，見表1。

四、各組大鼠肺組織IL-10表達水平比較

半定量研究結(jié)果顯示，各組肺組織IL-10陽性目標總面積經(jīng)方差分析，F(xiàn)=9.440，P=0.001，各組肺組織IL-10陽性目標總面積差異具有統(tǒng)計學意義。組間比較顯示，哮喘組明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，地塞米松組肺組織IL-10陽性目標總面積較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。對照組與地塞米松組相比無統(tǒng)計學差異。各組肺組織IL-10積分光密度經(jīng)方差分析，F(xiàn)=15.75，P=0.000，各組肺組織IL-10積分光密度差異具有統(tǒng)計學意義。組間比較顯示，哮喘組明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，地塞米松組肺組織IL-10積分光密度較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。對照組與地塞米松素組相比無統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。見表2。

五、各組大鼠肺組織肥大細胞(mast cell，MC)染色結(jié)果

各組大鼠肺組織MC染色結(jié)果如圖4-6所示。

圖4 正常組IL-10(HE 400×)

圖5 模型組IL-10(HE 400×)

圖6 治療組IL-10(HE 400×)

哮喘組氣管黏膜固有層可見較多脫顆粒MC，其細胞膜不完整，細胞形態(tài)不規(guī)則。表明MC處于激活狀態(tài)，而對照組則罕見脫顆粒的MC。地塞米松組肺組織MC較對照組明顯增加，但較哮喘組減少(圖7-9)各組大鼠肺組織MC脫顆粒率，見表3。

表1 各組大鼠氣道形態(tài)學指標()Table 1 The morpholiogical data of rats airway in three groups()

表1 各組大鼠氣道形態(tài)學指標()Table 1 The morpholiogical data of rats airway in three groups()

注:與對照組比較:aP ＜0.05;bP ＜0.01;與模型組比較:aP ＜0.05，bP ＜0.01

WAt/Pbm WAi/Pbm WAm/Pbm對照組組別6.54 ±1.31 2.52 ±1.59 4.02 ±1.88哮喘組 20.41 ±13.07a 3.33 ±4.40a 17.08 ±14.07a地塞米松組 9.52 ±1.12b 1.95 ±2.28 7.57 ±2.99b F 值 9.203 0.532 6.497 P值0.001 0.594 0.005

表2 各組大鼠肺組織IL-10表達比較()Table 2 Comparison of expression of IL-10 in lung tissue of rats()

表2 各組大鼠肺組織IL-10表達比較()Table 2 Comparison of expression of IL-10 in lung tissue of rats()

注:與正常組比較，aP ＜0.05;bP ＜0.01

組別 陽性目標總面積 積分光密度對照組94.5685 ±28.6526 33.1505 ±14.1408哮喘組 296.1034 ±164.0185a 79.1013 ±24.4391a地塞米松組 184.7126 ±69.1140b 46.3505 ±16.3981b F 值 9.440 15.75 P值0.001 0.000

表3 各組大鼠肺組織MC脫顆粒率比較(%，)Table 3 Comparison of MC degranulation rate in lung tissue of rats(%，)

表3 各組大鼠肺組織MC脫顆粒率比較(%，)Table 3 Comparison of MC degranulation rate in lung tissue of rats(%，)

注:與正常組比較，aP ＜0.05;bP ＜0.01

脫顆粒率對照組組別例數(shù) MC 10 76.63 ±6.3110 73.53 ±4.81哮喘組 10 87.13 ±14.41地塞米松組

圖7 正常組MC(HE 400×)

圖8 模型組MC(HE 400×)

圖9 f地塞米松MC(HE 400×)

六、相關性分析

為探討MC與IL-10在BA發(fā)病機制中的相關性，我們對哮喘組肺組織的MC脫顆粒率與IL-10表達水平進行相關性分析。研究結(jié)果顯示，哮喘組肺組織IL-10表達水平均與MC脫顆粒率呈正相關(r=0.62，P ＜0.01)。

討 論

哮喘是一種嚴重威脅人類健康的慢性呼吸道疾病。研究表明，哮喘的發(fā)病是由于Th2型細胞過度釋放細胞因子后誘導IgE產(chǎn)生，導致MC和嗜酸粒細胞脫顆粒，引起氣道速發(fā)性過敏反應和以嗜酸粒細胞、MC、T細胞等多種炎癥細胞參與的慢性氣道炎癥。

哮喘會導致氣道高反應性，其機制與炎癥引起的氣道平滑肌收縮反應性增強和氣道結(jié)構重建有關。氣道重構是支氣管哮喘的主要病理特征之一，這種重塑涉及到氣道各層組織，包括氣道壁增厚和基質(zhì)沉積，膠原沉積，上皮下纖維化，平滑肌增生和肥大，肌成纖維細胞增殖及黏液腺，杯狀細胞化生及增生，上皮下網(wǎng)狀層增厚，微血管生成等，由此引起的氣管不可逆狹窄和氣道持續(xù)高反應性，成為氣流不可逆性阻塞和支氣管哮喘反復發(fā)作的病理基礎［5-6］。目前認為氣道重塑與氣道慢性炎癥有關，炎癥、損傷、修復、重塑是一個不斷進展的病理過程，導致氣道壁增厚，促使氣道的狹窄和氣流的受限。

研究表明，氣道上皮的炎性損傷-修復-再損傷-再修復所導致的氣道重塑可能是哮喘病發(fā)展成難治性哮喘的重要病理生理學基礎。氣道重塑的發(fā)生機制與氣道內(nèi)炎性細胞釋放的炎癥促進因子和生長因子有關。其中IL-10是參與調(diào)節(jié)氣道炎癥的重要細胞因子。IL-10是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抗炎作用的細胞因子，亦稱細胞因子合成抑制因子，IL-10主要由激活的單核細胞、部分淋巴細胞和上皮細胞等產(chǎn)生，是一種作用強的免疫調(diào)節(jié)細胞因子，它的產(chǎn)生通常和炎癥的消除有關［7］。IL-10的生物學功能主要是抑制和終止炎癥反應，幾乎抑制所有促炎癥性細胞因子的合成與釋放，并促進抑炎性細胞因子IL-1受體拮抗劑的合成，因而具有抗炎作用。IL-10可抑制單核巨噬細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞產(chǎn)生的TNF-α，IL-1，IL-6，IL-12;也抑制單核巨噬細胞產(chǎn)生的趨化因子IL-8、巨噬細胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein，MIP-2)，抑制中性粒細胞和巨噬細胞的趨化性;IL-10抑制活化的單核細胞和粒細胞產(chǎn)生粒細胞單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、從而限制中性粒細胞的產(chǎn)生;IL-10還可抑制巨噬細胞產(chǎn)生氧自由基、氮氧化合物、金屬蛋白酶等。這些反應性因子釋放的減少縮短了炎癥反應的過程，從而限制了炎癥反應。IL-10還可抑制抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APC)，阻止T細胞受體介導的CD4+T細胞的活化，致使T細胞不應答，從而抑制多種細胞因子的產(chǎn)生，如:TNF-α、IL-6、IL-8等。TNF-α和IL-8參與哮喘發(fā)作期和緩解期的炎癥反應，屬調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥的上調(diào)因子，而IL-10是上述2種因子的抑制因子，具有抑制哮喘炎癥的作用，其含量降低可能為消耗性降低［8］。

本實驗采用卵白蛋白注射及霧化聯(lián)合應用復制哮喘大鼠模型，這種低劑量長期暴露于變應原的方法更能表現(xiàn)出慢性氣道炎癥的特征，能模擬哮喘患者反復接觸變應原使病情逐漸惡化的過程，同時也適用于糖皮質(zhì)激素的研究。結(jié)果顯示哮喘組大鼠氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，黏膜下水腫，黏膜下層增厚，管腔狹窄，有時可見黏液栓堵塞，氣道上皮細胞脫落，杯狀細胞增多，黏膜下及管周有大量炎性細胞浸潤，氣道形態(tài)學指標也提示了粘膜、平滑肌層及氣道壁的顯著增厚，說明反復抗原刺激后，氣道壁結(jié)構發(fā)生明顯改變?；贗L-10在哮喘發(fā)病機制中的重要作用，本研究結(jié)果初步表明哮喘組大鼠肺組織免疫組化標記IL-10陽性表達降低，結(jié)果與既往研究一致。

糖皮質(zhì)激素作為控制哮喘的首選用藥，可減少氣道炎癥細胞浸潤，減輕氣道炎癥，在控制氣道炎癥方面很有效［9］。有研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能在一定程度上抑制哮喘小鼠模型的氣道炎癥和氣道重塑，但早期應用地塞米松不能完全預防和逆轉(zhuǎn)氣道重塑［10-11］。

本實驗提示使用糖皮質(zhì)激素后，哮喘大鼠氣道重塑程度有所減輕，同時可增加氣道IL-10陽性表達。IL-10的增加有助于氣道炎性反應的抑制。哮喘大鼠氣道重塑程度的減輕提示地塞米松可有效通過增加氣道IL-10陽性表達發(fā)揮炎癥抑制作用，從而減輕氣道重塑，提高氣道功能，有助于支氣管哮喘動物模型的氣道功能的恢復。

在哮喘的慢性氣道炎癥中，參與的細胞有肥大細胞、嗜堿性粒細胞、T細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及多種結(jié)構細胞(如上皮細胞，內(nèi)皮細胞等)。近來研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者氣道平滑肌束中肥大細胞數(shù)量增加并呈脫顆粒狀態(tài)［12-14］。肥大細胞是具有多種生物學功能的組織細胞，在免疫激活后，根據(jù)分泌的時間不同，能分泌一系列炎癥介質(zhì)，包括IL-8，Eotaxin、Tryptase等。Tryptase能高效誘導嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞浸潤、持續(xù)性增加微血管通透性、刺激上皮細胞釋放IL-8，上調(diào)細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達、促進氣道組織纖維化，而炎癥細胞募集、血管通透性增加和ICAM-1高表達是哮喘炎癥的主要特征，因此推測肥大細胞可能在哮喘炎癥的發(fā)生、發(fā)展和氣道重建中起促進作用［15-18］。肥大細胞在支氣管中的正常存在，以及其能夠增強炎癥反應的特性，被認為與哮喘發(fā)作的病理生理有關。

本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘組大鼠肺組織肥大細胞脫顆粒率顯著高于對照組，表明哮喘氣道中存在肥大細胞脫顆粒過程。地塞米松組肥大細胞脫顆粒率明顯降低，提示地塞米松可穩(wěn)定肥大細胞膜，抑制肥大細胞脫顆粒。為探討肥大細胞與IL-10在支氣管哮喘發(fā)病機制中的相關性，我們對哮喘組肺組織的肥大細胞脫顆粒率與IL-10表達水平進行相關性分析。研究結(jié)果顯示，模型組肺組織IL-10表達水平均與肥大細胞脫顆粒率呈正相關(r2=0.62，P＜0.01)。表明地塞米松抑制肥大細胞與調(diào)節(jié)IL-10表達水平具有相關性，提示肥大細胞脫顆粒釋放細胞因子與調(diào)節(jié)IL-10表達水平有關。

綜合本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘大鼠長期吸入OVA變應原可導致氣道重塑，IL-10在氣道重塑中發(fā)揮了作用，地塞米松可通過抑制肥大細胞脫顆粒、提高IL-10表達發(fā)揮對氣道炎癥的抑制作用。

1 中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組.支氣管哮喘防治指南［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2008，31(3):177-185.

2 陳 強.支氣管哮喘與呼吸道重塑［J］.實用兒科臨床雜志，2004，19(10):819-821.

3 Palmans E，Kips JC，Pauwels RA.Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161(2):627-635.

4 Salmon M，Walsh DA，Koto H，et al.Repeated allergen exposure of sensitized Brown-Norway rats induces airway cell DNA synthesis and remodeling［J］.Eur Respir J，1999，14(3):633-641.

5 戚好文.哮喘氣道重建——支氣管哮喘研究中所面臨的挑戰(zhàn)［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2002，23(13):1153-1154.

6 Elias JA.Airway remodeling in asthma.Unanswered questions［J］.Am J Respir Crit Care Med，2000，161(3):168-171.

7 Hawry lowicz CM，O Garra A.Potential role of interleukin 10 secreting regulatory T cells in allergy and asthma［J］.Nat Rev Immuno，2005，5(4):271-283.

8 張國祥，許文龍.T淋巴細胞及其分泌的細胞因子與哮喘［J］.蚌埠醫(yī)學院學報，2008，33(1):125-126.

9 曹 巖，黃 穎，鐘莉莉，等.老年支氣管哮喘患者血清中白介素及腫瘤壞死因子的檢測及意義［J］.中國實驗診斷學，2009，13(12):197-199.

10 李 鋒，劉榮玉.氣道炎癥和重構在小鼠哮喘模型中的變化及地塞米松的干預作用［J］.中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2005，4(2):110-114.

11 沈華浩，王紹斌.布地奈德干預對卵白蛋白致敏小鼠抗原激發(fā)后氣道炎癥及氣道重塑的影響［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28(3):154-159.

12 Bradding P.The role of the mast cell in asthma:A reassessment［J］.Curropin Allergy Clin Immunol，2003，3(1):45-50.

13 Page S ，Ammit AJ，Black JL，et al.Human mast cell and airway smooth muscle cell interactions:Implications for asthma［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，281(6):1313-1323.

14 Bright ling CE，Bradding P，Symon FA，et al.Mast cell infiltrat ion of airway smooth muscle in asthma［J］.N Engl J Med ，2002，346(22):1699-1705.

15 He S，Walls AF.Human mast cell tryptase:a potent stimulus of microvascular leakage and mast cell activation［J］.Eur J Phar macol，1997，382:89-97.

16 He S，Pearman LJ，Liu WL，et al.Mast cell tryptase can induce secretion of mucus from human bronchial tissue［J］.Immunology，1999，98(Suppl 1):111.

17 Tunon De Lara JM，Berger P，Begueret H .Mast cells in the airway smooth muscle［J］.N Engl J Med，2002，347:1040-1041.

18 謝 華，孫 濱.哮喘患者血清中可溶性細胞間黏附分子(sICAM-1)表達和糖皮質(zhì)激素治療的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，1998，19(5):585-586.