楊云秀，胡孫寬，葉星照，白永恒，王斯璐，劉 彪，王本泉，陳必成，陳宗靜

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院1.肝膽胰外科;2.消化內(nèi)科;3.外科實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325000)

胰腺癌的臨床治療效果一直不理想，臨床常用的化療藥物不能顯著延長(zhǎng)胰腺癌患者的生存率，其5年生存率僅為3%。近年研究顯示，影響表觀遺傳的化學(xué)藥物具有抗腫瘤作用，除DNA甲基化外，組蛋白乙?；彩潜碛^遺傳修飾的重要內(nèi)容［1］。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase，HDAC)催化的乙?；磻?yīng)在真核基因的表達(dá)調(diào)控中起重要作用，可通過(guò)對(duì)核心組蛋白的可逆修飾來(lái)調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；?，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始和延伸。HDAC抑制劑能夠抑制HDAC的活性，改變組蛋白和非組蛋白的乙酰化水平，從而可以選擇性地調(diào)控部分腫瘤相關(guān)基因［2］。研究表明，HDAC抑制劑可通過(guò)改變組蛋白的乙?；癄顟B(tài)調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)、阻礙細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成以及改變熱激蛋白90的乙?；癄顟B(tài)等機(jī)制［3-6］，在體外誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯、分化或凋亡。曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是一種得到廣泛關(guān)注的HDAC抑制劑，本研究主要通過(guò)TSA體外處理胰腺癌細(xì)胞，檢測(cè)腫瘤增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因表達(dá)，探討TSA誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TSA購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，用二甲亞砜(DMSO，Sigma)溶解至 10 μmol·L-1，使用前用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol購(gòu)自Gibco BRL公司，Hoechst 33258購(gòu)自Sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenⅠ熒光定量試劑盒購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司，熒光PCR所用引物由周蒙滔教授饋贈(zèng)(引物序列見(jiàn)表1)。Notch受體胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)兔抗人一抗以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于Abcam生物公司。胱天蛋白酶3活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀為ELX800(Bio-Tek)產(chǎn)品，熒光 PCR儀為 ABI7500(ABI)。

Tab.1 Sequence of primers used with real-time PCR

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PANC-1培養(yǎng)在含10%胎牛血清、鏈霉素100 g·L-1、青霉素100 g·L-1的 DMEM 培養(yǎng)液里，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞處理后分組，TAS組加入 TAS 0.1，0.2，0.4 和0.6 μmol·L-1，正常對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PANC-1細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化，收集并調(diào)整細(xì)胞密度為5×107L-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入100 μl終濃度為 0.1，0.2，0.4 和0.6 μmol·L-1的 TSA，分別作用 0，12，24 和 48 h，正常對(duì)照組不加TSA，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零組〔不加細(xì)胞僅加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)〕。培養(yǎng)結(jié)束前4 h 每孔加入 20 μl MTT(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min左右，使結(jié)晶充分溶解后，立即于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(absorbance，A490nm)。計(jì)算腫瘤細(xì)胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)，IR(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組A490nm-空白組A490nm)/(正常對(duì)照組A490nm-空白組A490nm)×100%。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔。

1.4 Hoechst 33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡

TSA 0.4 μmol·L-1處理0，12，24，48 h 后，移去培養(yǎng)基，用冷PBS洗2次，4%甲醛液固定10 min，棄固定液，雙蒸水沖洗2次，Hoechst 33258(5 mg·L-1)避光染色5 min，然后用雙蒸水沖洗2次，室溫下涼干后于熒光(激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm)顯微鏡下觀察，并隨機(jī)選取位置進(jìn)行拍照。

1.5 胱天蛋白酶3活性的測(cè)定

將PANC-1細(xì)胞接種在 12孔板后，TSA 0.4 μmol·L-1處理細(xì)胞 0，4，8 和 12 h 后，按照胱天蛋白酶3活性測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)靶基因表達(dá)

取 TSA 0.4 μmol·L-1處理 24 h 和正常對(duì)照組細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取兩組細(xì)胞的總RNA，每組吸取2 μg RNA樣本在10 μl體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增體系:5 μl 2 ×SYBR Green 熒光定量試劑、2 μl引物(上、下游各 1 μl，終濃度 200 nmol·L-1)、2 μl反應(yīng)緩沖液、1 μl cDNA。檢測(cè)靶基因包括:存活素、p53、c-myc、Bcl-2，Bax、金屬蛋白酶1組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 1，MMP1)以及Notch通路關(guān)鍵分子Notch-1。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 10 min，95℃ 15 s，62℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)。得到的 Ct值用 2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)。

1.7 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)NICD蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集后，分別以2×105個(gè)細(xì)胞接種于含載玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞至 80% ～90%融合后，分別用 TSA 0，0.4和0.6 μmol·L-1處理 24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗細(xì)胞3次，用4%多聚甲醛固定60 min。5% ～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，在各細(xì)胞爬片上滴加一抗工作液抗NICD，37℃孵育l h，PBS沖洗3次，滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30 min;PBS沖洗3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色，細(xì)胞胞質(zhì)和胞核呈棕黃色為陽(yáng)性著色，蘇木精復(fù)染后常規(guī)脫水、透明、封片。每組取3張片，每張片子取8個(gè)高倍視野(200×)，運(yùn)用Image Pro Plus軟件分析NICD染色的平均吸光度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TSA對(duì)PANC-1細(xì)胞存活的影響

圖1結(jié)果顯示，TSA對(duì)PANC-1細(xì)胞存活有顯著的抑制作用，且抑制作用具有較好的量效(r=0.640，P=0.01)和時(shí)效(r=0.768，P=0.002)關(guān)系。作圖法求出TSA的半數(shù)抑制濃度為12 h:IC50=0.42 μmol·L-1;24 h:IC50=0.32 μmol·L-1;48 h:IC50=0.19 μmol·L-1。

Fig.1 Effect of trichostatin A(TSA)on PANC-1 cell porliferation by MTT.，n=6.

2.2 TSA誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡

TSA 0.4 μmol·L-1分別處理 0，12，24 和 48 h，Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TSA處理的正常細(xì)胞核染色較淡(圖2A)，早期凋亡細(xì)胞核由于染色體發(fā)生皺縮而染成亮藍(lán)色容易與正常細(xì)胞區(qū)分。隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞核亮藍(lán)色染色比例明顯增加，TSA作用48 h PANC-1細(xì)胞核染成亮藍(lán)色數(shù)目最多(圖2B，C，D)。

2.3 TSA對(duì)PANC-1細(xì)胞胱天蛋白酶3活性的影響

圖3 結(jié)果示，TSA 0.4 μmol·L-1處理0，4，8 和12 h后，PANC-1細(xì)胞內(nèi)激活的胱天蛋白酶3隨時(shí)間的增加活性增強(qiáng)，分別為正常對(duì)照組的(1.62±0.12)倍，(2.68 ±0.17)倍和(3.92 ±0.23)倍(F=97.8，P ＜0.01)。

Fig.3 Effect of TSA on caspase 3 activity of PANC-1 cells.PANC-1 cells were cultured with TSA 0.4 μmol·L-1for 0，4，8 and 12 h.，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control(0 h)group.

2.4 TSA對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)的影響

表4結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，TSA 0.4 μmol·L-1作用 PANC-1 細(xì)胞 24 h 后凋亡相關(guān)基因存活素，c-myc和p53 mRNA表達(dá)均明顯下降，Bax表達(dá)明顯上升，Bcl-2 mRNA未見(jiàn)明顯變化，但Bcl-2/Bax值降低明顯，僅為對(duì)照組的14%。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP1和TIMP1 mRNA的表達(dá)顯著升高(F=39.2，P=0.003;F=9.5，P=0.039)。

Fig.2 Effect of TSA on PANC-1 cell apoptosis detected by Hoechst 33258 staining(× 200).A-D:TSA 0.4 μmol·L-1treated PANC-1 for 0，12，24 and 48 h，respectively.Arrows show apopotic cells.

Tab.4 Effect of TSA on apoptosis-related and metastasis-related gene expression in PCNA-1

2.5 TSA對(duì)PANC-1細(xì)胞Notch-1 mRNA及其活化分子NICD表達(dá)的影響

TSA 0.4 μmol·L-1處理 PANC-1 細(xì)胞 24 h 后，Notch-1 mRNA表達(dá)與正常對(duì)照組相比變化不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.87，P＞0.05)。細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)Notch-1的活化分子NICD發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組僅顯示蘇木素藍(lán)染的細(xì)胞核(圖4A)，而TSA 0.4和0.6 μmol·L-1作用24 h均有棕黃色 NICD 染色陽(yáng)性細(xì)胞，并隨藥物濃度增加陽(yáng)性細(xì)胞棕黃色逐漸加深(圖4B，C)。Image Pro Plus軟件定量分析結(jié)果顯示，TSA 0.4 和0.6 μmol·L-1組 NICD 蛋白的相對(duì)表達(dá)分別為 0.143 ±0.009 和 0.264 ±0.013，與正常對(duì)照組0.072 ±0.009相比有明顯差異(F=131.1，P ＜0.05)。

Fig.4 Effect of TSA on expression of Notch intracellular domain(NICD)in PANC-1 cells by immunocytochemistry(× 200).A:normal control;B:TSA 0.4 μmol·L-1for 24 h;C:TSA 0.6 μmol·L-1for 24 h.

3 討論

組蛋白乙?；钦{(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳修飾的一種，調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化程度主要有組蛋白乙?；负虷DAC的相互協(xié)調(diào)來(lái)完成。組蛋白乙?；蓙y可能會(huì)導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)變化，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、分化以及凋亡的基因轉(zhuǎn)錄水平的失調(diào)，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)導(dǎo)致凋亡［7］。由于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都呈高度乙?；癄顟B(tài)［8］，因此具有抑制HDAC的活性的化療藥物成為抗癌治療的研究熱點(diǎn)。TSA是一種去乙?；敢种苿軌蛴行У匾种艸DAC的活性，促進(jìn)組蛋白和非組蛋白的乙?；揎?，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)、增殖以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和降解，活化凋亡信號(hào)通路［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSA可以抑制PCNA-1的生長(zhǎng)導(dǎo)致其凋亡，并通過(guò)MTT法、Hoechst 33258核染色和胱天蛋白酶3的激活情況得以證實(shí)。雖然TSA并不影響Notch-1的表達(dá)，但是NICD表達(dá)增加，提示Notch通路激活。并且TSA可上調(diào)凋亡基因的表達(dá)如Bax，下調(diào)抗凋亡基因c-myc，存活素和Bcl-2 mRNA的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中TSA誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡特性，同時(shí)伴隨著凋亡相關(guān)基因的改變。

研究發(fā)現(xiàn)，TSA能通過(guò)它的氧肟酸螯合HDAC活化位點(diǎn)上的鋅離子而抑制Ⅰ型和Ⅱ型 HDAC的活性，達(dá)到調(diào)控基因表達(dá)的作用，從而改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)重要的生長(zhǎng)通路促進(jìn)其凋亡［10］。目前已有文獻(xiàn)證明TSA可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，而細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和發(fā)展受到多種蛋白酶的控制，控制凋亡的途徑主要有兩條:死亡受體途徑和線粒體途徑。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的經(jīng)典途徑，在凋亡的過(guò)程中胱天蛋白酶3被激活而發(fā)揮功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胱天蛋白酶3活性隨著TSA作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，與Sato等［11］研究結(jié)果相一致，可見(jiàn)MTT方法檢測(cè)到的細(xì)胞增殖抑制是通過(guò)TSA誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡的結(jié)果，在這一過(guò)程中大量胱天蛋白酶3被激活;同時(shí)Hoechst 33258熒光染色也證實(shí)了大量細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

P53可調(diào)控凋亡途徑中的多種蛋白如Bax和Apaf1，但 PANC-1 表達(dá)的可能為突變的 P53［12］，TSA下調(diào)突變p53 mRNA的表達(dá)促進(jìn)其凋亡。存活素作為凋亡抑制蛋白家族之一，在正常組織中不表達(dá)，而在腫瘤組織中有較高的表達(dá)，是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，可直接作用于細(xì)胞凋亡途徑中胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶7抑制細(xì)胞凋亡，其抑制凋亡的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Bcl-2家族［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TSA處理細(xì)胞導(dǎo)致存活素mRNA表達(dá)明顯下降，可通過(guò)減除對(duì)胱天蛋白酶3的抑制而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。尤其是Bcl-2/Bax蛋白比率的降低被認(rèn)為是凋亡過(guò)程中一個(gè)重要因素。二者在線粒體膜上形成二聚體，調(diào)控著線粒體膜的通透性。當(dāng)其比值降低時(shí)，線粒體膜通透性升高，細(xì)胞色素c大量釋放，進(jìn)而激活胱天蛋白酶3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TSA對(duì)Bcl-2 mRNA表達(dá)無(wú)影響，但顯著升高Bax mRNA表達(dá)，導(dǎo)致Bcl-2/Bax mRNA比率降低。表明線粒體通路參與了TSA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

Notch通路在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化過(guò)程中起重要作用，因而成為治療腫瘤的重要靶點(diǎn)。但研究者對(duì)Notch通路激活影響細(xì)胞凋亡的意見(jiàn)卻不盡一致，Wang等［14］發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞Notch通路可抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而Greenblat等［15］則發(fā)現(xiàn)在髓質(zhì)型甲狀腺癌中，Notch 通路的激活可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。由此可見(jiàn)可能是由于腫瘤性質(zhì)不同，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。在本研究中，TSA并不影響Notch-1 mRNA表達(dá)，但對(duì)Notch通路有激活作用，活化分子NICD蛋白入核現(xiàn)象明顯。同樣MMP1和TIMP-1也具有一定的抗凋亡作用。在誘導(dǎo)凋亡的模型中，廣譜MMP1抑制劑會(huì)增加胱天蛋白酶3活性和DNA片段出現(xiàn)的時(shí)間［16］，推測(cè)MMP1具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。研究結(jié)果顯示，TSA使PANC-1細(xì)胞MMP1和TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯升高，其凋亡機(jī)制可能激活Notch通路、MMP1和TIMP-1通路有關(guān)。

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