張秀麗，于德紅，劉德勝，劉秀珍，張樹平

(1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生物制藥教研室，山東 煙臺(tái) 264003;2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871;3.河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 006300)

帕金森病(Parkinson disease，PD)的臨床癥狀以靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌張力增高和姿勢(shì)平衡障礙等為主要特征，病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失、殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體。該病嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)和生活能力，并能導(dǎo)致殘障。雖然目前對(duì)于PD的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚，但流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期暴露于環(huán)境毒素如殺蟲劑中的人群，患PD的概率會(huì)大大增加［1］。

魚藤酮(rotenone)是從魚藤的根部提取的一種天然殺蟲劑，具有親脂性，可透過血腦屏障，對(duì)腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性具有抑制作用［2］。鑒于PD是一種神經(jīng)功能障礙性疾病，與細(xì)胞線粒體異常有關(guān)，因此，作為線粒體復(fù)合物抑制劑的魚藤酮可能是PD發(fā)病的潛在致病因素。研究表明，魚藤酮對(duì)線粒體復(fù)合物的抑制作用可以導(dǎo)致大量的自由基和凋亡誘發(fā)因子的產(chǎn)生，二者均可引起神經(jīng)元退變，業(yè)已證實(shí)PD患者的黑質(zhì)紋狀體線粒體復(fù)合物的活性確有明顯下降。因此，利用魚藤酮模擬的PD動(dòng)物模型被廣泛用于疾病的發(fā)病機(jī)制和治療藥物研究［3］。

梓醇(catalpol)是一種環(huán)烯醚萜類的小分子化合物，研究表明，梓醇能夠抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的中腦多巴胺神經(jīng)元損傷［4］，提高腦室注射淀粉樣 β蛋白(amyloid beta protein，Aβ)誘導(dǎo)損傷的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力［5-6］。近期研究發(fā)現(xiàn)，梓醇對(duì)蛋白酶體抑制劑乳胞素(lactacystin)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與梓醇提高SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)20S蛋白酶體含量有關(guān)［7］。

線粒體作為細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換和物質(zhì)氧化的場(chǎng)所，是維持細(xì)胞以至整個(gè)機(jī)體生理功能的能源基礎(chǔ)，也是體內(nèi)活性氧自由基的主要來源。當(dāng)線粒體功能受損時(shí)，細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換不足，ATP合成降低，導(dǎo)致細(xì)胞以至整個(gè)機(jī)體生理功能的降低。PD患者腦黑質(zhì)中酶復(fù)合體Ⅰ異常，導(dǎo)致自由基增多，損害線粒體膜及mtDNA，進(jìn)而引起能量合成障礙，這又將導(dǎo)致大量的自由基生成，從而形成惡性循環(huán)。此外，自由基還可損害細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性以及損害溶酶體膜，引起溶酶體的釋放，水解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，造成黑質(zhì)細(xì)胞的死亡。本研究旨在探討梓醇對(duì)魚藤酮引起的神經(jīng)損傷是否有效，重點(diǎn)考察其對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性的影響以及線粒體自由基生成和線粒體膜電位的變化，以期為梓醇在PD疾病的藥物開發(fā)和基礎(chǔ)研究中提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠(24只)，雌雄各半，體質(zhì)量(25.0±3.0)()g，購自煙臺(tái)綠葉制藥有限公司，動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(魯)20030020。

1.2 藥物和試劑

梓醇，中國藥品生物制品檢定所;魚藤酮，Sigma公司;mtNOS和線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程公司。魚藤酮以二甲亞砜(DMSO，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司)溶解后加入等量聚乙二醇(PEG400，北京化學(xué)試劑公司)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

小鼠分籠喂養(yǎng)于室內(nèi)，光照12 h，溫度23～27℃，自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、魚藤酮模型組、梓醇治療組和預(yù)防組，每組雌雄各半(共6只)。梓醇預(yù)防組，ip給予梓醇10 mg·kg-1，連續(xù)7 d后，改ip給予魚藤酮1.5 mg·kg-1，連續(xù) 28 d;魚藤酮模型組和梓醇治療組ip給予魚藤酮1.5 mg·kg-1，連續(xù)28 d后，改 ip給予DMSO或梓醇10 mg·kg-1，連續(xù)7 d。

1.4 小鼠腦組織線粒體的制備及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

最后一次藥物注射結(jié)束后，應(yīng)用乙醚將小鼠深度麻醉，用100 ml冰冷的生理鹽水經(jīng)心臟做顱內(nèi)灌注，在冰袋上小心快速剝離中腦和紋狀體，-70℃冰箱內(nèi)保存。分離線粒體時(shí)取組織稱重后按1∶9(W/V)比例加入預(yù)冷的勻漿液(mmol·L-1:蔗糖250，EDTA 0.5，Tris-HCl 10，pH 7.4)置于玻璃勻漿器中冰浴手動(dòng)勻漿。2000×g離心3 min，取上清液，12000×g離心8 min。將沉淀仔細(xì)懸于Ficoll梯度中，11500×g離心30 min，棄上清液，沉淀用勻漿液洗1次，12000×g離心8 min，所得沉淀即為線粒體。以上所有操作均在4℃進(jìn)行?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定線粒體懸液的蛋白含量，調(diào)整濃度為線粒體蛋白2 g·L-1。將線粒體懸液分裝后-70℃保存，保存時(shí)間不超過2周。

1.5 線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅱ+Ⅲ和Ⅳ活性的測(cè)定

將線粒體蛋白于測(cè)定前置于20℃/-20℃反復(fù)凍融3次，使之成為線粒體膜片段以進(jìn)行線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性測(cè)定。

呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅰ活性測(cè)定是通過加入外源性NADH和泛醌模擬電子轉(zhuǎn)運(yùn)過程而實(shí)現(xiàn)的，反應(yīng)時(shí)NADH脫電子轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+，在340nm處吸光度下降。CoQ10(60 μmol·L-1)，抗霉素 A(2 mg·L-1)，牛血清白蛋白(2.5 g·L-1)，NADH 130 μmol·L-1加入反應(yīng)緩沖體系(mmol·L-1:KH2PO435;MgCl25;Na3N 2.1，pH 7.2)中，30℃ 溫孵 3 min。加入30～50 μg線粒體蛋白啟動(dòng)反應(yīng)，1 min內(nèi)連續(xù)測(cè)定A340nm值的變化，根據(jù)1 min A340nm值的變化反映呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅰ的活性，單位μmol·min-1·g-1蛋白。

酶復(fù)合體Ⅱ活性的測(cè)定:是通過加入外源性琥珀酸和泛醌模擬電子轉(zhuǎn)運(yùn)過程而實(shí)現(xiàn)的。測(cè)定的原理為:反應(yīng)時(shí)DCPIP接受電子，在600 nm處吸光度下降;酶復(fù)合體Ⅱ+Ⅲ活性的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)體系中加入外源性琥珀酸和鐵氰化鉀，電子通過復(fù)合體Ⅱ和Ⅲ進(jìn)行傳遞，通過檢測(cè)鐵氰化鉀在420 nm處吸光度的變化來計(jì)算琥珀酸-鐵氰鹽還原酶活性;酶復(fù)合體Ⅳ活性的測(cè)定:實(shí)驗(yàn)體系中加入外源性還原型細(xì)胞色素c，最終將電子轉(zhuǎn)移給氧氣生成水;自身則轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸图?xì)胞色素c。通過檢測(cè)氧化型細(xì)胞色素c 550 nm處吸光度的變化即可計(jì)算該酶復(fù)合體的活性，單位 μmol·min-1·g-1蛋白。

呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅱ/Ⅲ活性測(cè)定:鐵氰化鉀(50 mmol·L-1)，抗霉素 A(2 mg·L-1)，琥珀酸鈉(20 mmol·L-1)，牛血清白蛋白(1.5 g·L-1)，魚藤酮(2 mg·L-1)加入反應(yīng)緩沖體系(mmol·L-1:KH2PO40.1;HEPES 10;KCl 130;EDTA 1，pH 7.2)中，30℃ 溫孵 10 min。加入線粒體蛋白50～200 μg啟動(dòng)反應(yīng)，1 min內(nèi)連續(xù)測(cè)定 A420nm值的變化。以1 min A420nm值的變化反映呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅱ活性，單位 μmol·min-1·g-1蛋白。

呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅳ活性測(cè)定:線粒體蛋白40 ～60 μg加入反應(yīng)緩沖體系(8.8 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)加入0.1%還原型細(xì)胞色素c(以過量維生素C還原至A550nm/A565nm＞12)啟動(dòng)反應(yīng)，1 min內(nèi)連續(xù)測(cè)定細(xì)胞色素c A550nm值的變化，反映呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅳ的活性，單位μmol·min-1·g-1蛋白。

1.6 線粒體一氧化氮合酶(mitochondrial nitric oxide synthase，mtNOS)活性的測(cè)定

mtNOS活性的測(cè)定利用專用的試劑盒，根據(jù)操作提示完成(南京建成生物工程研究所)。酶活定義為每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個(gè)mtNOS 活力單位(U)，即 kU·g-1蛋白。

1.7 線粒體膜電位的測(cè)定

線粒體膜電位采用熒光染料羅丹明123進(jìn)行檢測(cè)［8］。反應(yīng)緩沖液(mmol·L-1:蔗糖15，MgCl25;琥珀酸鈉 5;K2HPO45;HEPES 20;pH 7.4)90 μl，10 μl羅丹明 123100 mg·L-1，加入線粒體蛋白10 μg室溫放置30 min(避光)后于熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)羅丹明123的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm)。每組結(jié)果用其熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)占正常對(duì)照組FI的百分比表示。

1.8 線粒體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的測(cè)定

ROS水平的變化使用2'，7'-二氯熒光素二乙酸(DCF-DA)檢測(cè)［9］。用 HEPES 緩沖液(mmol·L-1:NaCl 120，KCl 2.5，NaH2PO41.2，MgCl20.1，NaHCO35.0，葡萄糖 6.0，CaCl21.0，HEPES 10，pH=7.4)170 μl將線粒體 1 ～ 10 μg 混勻，加入DCF-DA(終濃度 1 mmol·L-1)，30℃放置 30 min，于GENIOS熒光酶標(biāo)儀上檢測(cè)DCFH-DA的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm)。每組結(jié)果用其FI占正常對(duì)照組FI的百分比表示。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 梓醇對(duì)魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ+Ⅲ和Ⅳ活性的影響

表1結(jié)果顯示，與正常組相比，魚藤酮模型組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性下降(P＜0.01)。與魚藤酮模型組相比，梓醇治療組和梓醇預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ活性上升(P＜0.01);線粒體復(fù)合物Ⅳ活性也表現(xiàn)上升趨勢(shì)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)。與正常組比較，模型組、梓醇治療組和梓醇預(yù)防組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅱ和Ⅱ+Ⅲ活性變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Effect of catalpol on mitochondrial complex activities in mesencephalon and striatum in mice induced by rotenone

2.2 梓醇對(duì)魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位的影響

表2結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體膜電位下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比較，梓醇治療組和預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

Tab.2 Effect of catalpol on mitochondrial membrane potential level in mesencephalon and striatum in mice induced by rotenone

2.3 梓醇對(duì)魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體mtNOS活性的影響

表3結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠造模后中腦和紋狀體mtNOS活性顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);與模型組相比較，梓醇治療組和預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體mtNOS活性顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

Tab.3 Effect of catalpol on mtNOS in mesencephalon and striatum in mice induced by rotenone

2.4 梓醇對(duì)魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體ROS的影響

表4結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體內(nèi)ROS的生成顯著增多(P ＜0.05或 P ＜0.01);與模型組相比較，梓醇治療組和預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體線粒體內(nèi)ROS的生成顯著減少(P ＜0.05)。

Tab.4 Effect of catalpol on formation of reactive oxygen species(ROS)in mesencephalon and striatum mitochondria in mice induced by rotenone

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸鏈、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的主要場(chǎng)所。其內(nèi)膜上的線粒體酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅴ組成線粒體呼吸鏈氧化磷酸化系統(tǒng)，產(chǎn)生能量，維持細(xì)胞的正常功能。酶復(fù)合體Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ在能量代謝中起著重要作用，它們活性的改變必將影響能量代謝，且它們的功能變化直接或間接地反映線粒體的呼吸功能變化。許多研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激與帕金森發(fā)病密切相關(guān)［10-11］。因此研究線粒體呼吸鏈上酶活性的變化對(duì)研究線粒體功能障礙具有重要的意義。

線粒體參與各種各樣的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，其中會(huì)有超氧負(fù)離子、羥基自由基和過氧化氫的產(chǎn)生。這些ROS能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激，從而進(jìn)一步損害細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。特別是線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ與超氧化物的產(chǎn)生密切相關(guān)。復(fù)合物活性的抑制會(huì)導(dǎo)致自由基產(chǎn)生的增多。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)的氧化產(chǎn)物超過內(nèi)源性抗氧化物時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞組織發(fā)生氧化損傷?；钚匝蹩梢l(fā)多不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，影響細(xì)胞的功能，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］。在PD的研究過程中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒素魚藤酮由于其自身的親脂性，可以透過血腦屏障，抑制腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ功能，使活性氧物質(zhì)等產(chǎn)生增加，導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元損傷、死亡，引起和臨床類似PD的癥狀，大量體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明魚藤酮可以作為制備PD動(dòng)物模型的神經(jīng)毒素［13-14］。

本研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮可導(dǎo)致小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性的下降，ROS產(chǎn)生增多;但對(duì)復(fù)合物Ⅱ和Ⅱ+Ⅲ活性無顯著影響。梓醇治療7 d和梓醇預(yù)處理7 d的小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性都較模型組有所提高，ROS的產(chǎn)生顯著降低，而線粒體復(fù)合物Ⅱ和Ⅱ+Ⅲ活性與正常組比較沒有顯著性差異。說明梓醇通過提高線粒體復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ活性，使呼吸鏈功能趨于正常，進(jìn)而減少了線粒體ROS生成。

線粒體膜電位是維護(hù)線粒體內(nèi)外物質(zhì)平衡、保持線粒體功能正?；顒?dòng)所必需的。一旦線粒體膜電位下降或者消散，各種凋亡相關(guān)因子，如細(xì)胞色素c、凋亡蛋白酶激活因子、凋亡誘導(dǎo)因子等，都從線粒體釋放出來，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終觸發(fā)神經(jīng)元凋亡［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)魚藤酮可導(dǎo)致小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位顯著下降;梓醇治療7 d和梓醇預(yù)處理7 d的小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位顯著上升。

mtNOS催化L-精氨酸生成的NO，也是ROS的一種。mtNOS及其產(chǎn)生的NO在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病中具有重要作用［16］。本研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮可導(dǎo)致小鼠中腦和紋狀體線粒體內(nèi)膜上的mtNOS活性升高;梓醇治療7 d和梓醇預(yù)處理7 d的小鼠中腦和紋狀體mtNOS活性顯著降低。

梓醇是從天然藥物地黃中分離的環(huán)烯醚萜類化合物，我們前期研究發(fā)現(xiàn)梓醇在阿爾茨海默病和PD等神經(jīng)退行性疾病中的活性作用，能抑制1-甲基-4-苯基吡啶［4］和脂多糖引起的原代培養(yǎng)的中腦多巴胺神經(jīng)元凋亡［17］，還能提高 D-半乳糖損傷小鼠皮質(zhì)內(nèi)源性抗氧化酶的活性和線粒體功能［18-19］。本研究從線粒體酶活性的角度觀察梓醇對(duì)PD小鼠中腦和紋狀體的保護(hù)作用，從結(jié)果可以推測(cè)梓醇可能通過阻止線粒體酶復(fù)合體活性的下降，減少線粒體內(nèi)ROS的生成，抑制線粒體膜電位的下降，進(jìn)而維持線粒體的功能，以減緩PD的發(fā)展。

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