劉 亮， 杜 江， 陳東林， 丁麗娜， 馮 華

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州遵義563002;2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002;3.遵義市藥品檢驗(yàn)所，貴州遵義563000)

觀音草Reineckia carnea(Andr.)Kunth為百合科植物吉祥草的帶根全草，又名結(jié)實(shí)蘭，竹葉草，佛頂珠，小青膽，是一味著名的苗藥。苗醫(yī)藥理論認(rèn)為其藥性為性冷，質(zhì)征為氣微味甜，入熱經(jīng)，走肺、肝二架，表、中、里三關(guān)。治療肺熱咳嗽、跌打損傷、瘡毒等。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)觀音草在工藝優(yōu)選方面的研究極少，難以進(jìn)行深入開發(fā)。因此，建立觀音草中總皂苷的提取純化工藝具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)探討了不同型號(hào)大孔樹脂對(duì)分離純化觀音草總皂苷的影響，在此基礎(chǔ)上優(yōu)選出總皂苷的最佳純化工藝。

1 儀器與試藥

UV75-18可見分光光度計(jì) (天津市拓普儀器有限公司);DHG 90AOA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (寧波江南儀器廠);Senco R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海申生科技有限公司);FY130型藥物粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司);DKS-26型電熱恒溫水浴鍋 (寧波江南儀器廠)。

薯蕷皂苷對(duì)照品購于上海華壹生物科技有限公司 (批號(hào):19057-60-4);觀音草藥材采集于貴州遵義，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校張學(xué)愈副教授鑒定為百合科植物觀音草Reineckia carnea(Andr.)Kunth;大孔樹脂 HPD100，HPD200A，HPD300，HPD700，D101(滄州寶恩化工有限公司);其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 觀音草總皂苷定量分析方法的建立及樣品溶液預(yù)處理方法 精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品1.2 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。分別精密移取薯蕷皂苷對(duì)照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于10 mL具塞試管內(nèi)，揮干甲醇，再分別加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，搖勻，密塞，60℃水浴顯色15 min，取出后立即用冰水冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻，靜置10 min，于460 nm處測定其吸光度。以吸光度 (A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度 (C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，薯蕷皂苷在4～24 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為 A=0.019121C+0.006133，r=0.9995［1］。

大孔樹脂分離工藝中所得的觀音草總皂苷洗脫流份，回收乙醇至干，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，準(zhǔn)確吸取10 mL于分液漏斗中，用水飽合正丁醇分4次萃取(15、10、10、10 mL)，正丁醇萃取液用正丁醇飽和的水20 mL洗滌，減壓回收正丁醇至干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?5 mL量瓶中，按上述紫外分光光度法進(jìn)行總皂苷的含有量測定。

2.2 供試液的制備 稱取觀音草藥材粗粉50 g，用8倍量70%乙醇加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液回收乙醇至干，加蒸餾水溶解并定容至200 mL，用石油醚分6次萃取 (300、200、200、200、200、200 mL)，棄去石油醚液，水溶液過濾，定容至500 mL。

2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 分別稱取5種型號(hào) (D101，HPD100，HPD200A，HPD300，HPD700)的大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，裝柱，用95%乙醇洗至1 mL洗脫液與3 mL蒸餾水混合澄清為止，再用蒸餾水洗至無醇，備用。2.4 不同型號(hào)大孔樹脂的靜態(tài)吸附及解析的研究 分別稱取經(jīng)預(yù)處理的各型號(hào)的樹脂0.5 g置于錐形瓶中，加入供試液30 mL，每隔10 min振搖30 s，持續(xù)2 h，靜置24 h后，抽濾，得吸附后的濾液。將吸附后的樹脂置于錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，其余操作同上，得解吸后的濾液。按2.1項(xiàng)下操作并進(jìn)行總皂苷的含有量測定，計(jì)算樹脂對(duì)總皂苷的靜態(tài)飽和吸附量，洗脫量及洗脫率［2］。結(jié)果見表1。

表1 5種樹脂靜態(tài)飽和吸附量及靜態(tài)洗脫率

由表1結(jié)果可知，各樹脂飽和吸附量，洗脫量及洗脫率相差較大，綜合考慮3個(gè)因素，后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定選擇HPD100型大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化觀音草總皂苷的工作。

2.5 HPD100大孔吸附樹脂的上樣吸附時(shí)間考察 分別準(zhǔn)確稱取0.5 g預(yù)處理過的HPD100大孔吸附樹脂置于6個(gè)100 mL錐形瓶中，加入供試液30 mL，搖勻，分別靜止吸附0.5、1、2、4、6、8 h，過濾，濾液按2.1項(xiàng)下操作并進(jìn)行總皂苷的含有量測定，計(jì)算各吸附液中總皂苷的吸附量達(dá)飽和吸附量的比率。結(jié)果見圖1。

圖1 HPD100大孔吸附樹脂上樣吸附時(shí)間考察

如圖1所示，當(dāng)吸附時(shí)間達(dá)到8 h時(shí)，樹脂靜態(tài)吸附量達(dá)到73.79 mg，達(dá)飽和吸附量的86.25%。吸附時(shí)間在2 h之前，觀音草總皂苷的吸附率提高較明顯，而2 h之后則無明顯增加，故確定上樣吸附時(shí)間定為2 h，可在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的吸附效率［3］。

2.6 HPD100大孔吸附樹脂的動(dòng)態(tài)吸附量的考察 準(zhǔn)確稱取4 g預(yù)處理過的HPD100大孔吸附樹脂，共3份，濕法裝柱。準(zhǔn)確吸取供試液 160 mL，上樣預(yù)吸附 2 h后，以3 BV/h的體積流量進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后，再用蒸餾水8BV以5BV/h的體積流量洗脫至近無色，合并過柱液及水洗液并定容至250 mL，按2.1項(xiàng)下操作并進(jìn)行總皂苷的含有量測定，結(jié)果平均動(dòng)態(tài)吸附容量為55.33 mg/g(n=3)，RSD為1.22%。

2.7 HPD100大孔吸附樹脂洗脫溶劑濃度的考察 準(zhǔn)確稱取4 g預(yù)處理過的HPD100大孔吸附樹脂，濕法裝柱。準(zhǔn)確吸取供試液80 mL，上樣預(yù)吸附2 h，之后，以3 BV/h的體積流量進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后，再用蒸餾水8 BV以5 BV/h的體積流量洗脫至近無色，再依次用15%、30%、50%、70%、90%乙醇各4 BV洗脫，洗脫體積流量為3 BV/h，分別收集各濃度段洗脫液，按2.1項(xiàng)下操作并進(jìn)行總皂苷的含有量測定，計(jì)算洗脫量及洗脫率。結(jié)果見表2。

表2 洗脫溶劑濃度考察

由表2可以看出，觀音草總皂苷主要集中在50%乙醇洗脫液中，而70%乙醇洗脫液中總皂苷相對(duì)較少，從節(jié)約成本考慮，可以選擇50%的乙醇進(jìn)行洗脫，但實(shí)際操作過程中50%乙醇是否能有效地將總皂苷完全洗脫下來，還應(yīng)比較50%及70%乙醇的洗脫效率。

2.8 HPD100大孔吸附樹脂洗脫溶劑用量的考察 準(zhǔn)確稱取4 g預(yù)處理過的HPD100大孔吸附樹脂，共2份，濕法裝柱。準(zhǔn)確吸取供試液80 mL，上樣預(yù)吸附2 h后，以3 BV/h的體積流量進(jìn)行吸附，吸附結(jié)束后，再用蒸餾水8 BV以5 BV/h的體積流量洗脫至近無色，再分別選用50%及70%乙醇以3 BV/h的體積流量洗脫6 BV，每1 BV收集1份，按2.1項(xiàng)下操作并進(jìn)行總皂苷的含有量測定，計(jì)算洗脫量及洗脫率。結(jié)果見表3。

表3 洗脫溶劑用量的考察

由表3可以看出，70%乙醇洗脫用量達(dá)到3 BV時(shí)，即可將總皂苷完全洗脫下來，而50%乙醇需要5 BV才能將總皂苷完全洗脫下來，故綜合表2及表3確定洗脫含乙醇量為70%，洗脫用量為3 BV。

2.9 HPD100大孔吸附樹脂吸附及洗脫速度的考察 準(zhǔn)確稱取4 g預(yù)處理過的HPD100大孔吸附樹脂，共5份，濕法裝柱。準(zhǔn)確吸取供試液80 mL，上樣預(yù)吸附2 h，吸附完成后，用蒸餾水8 BV以5 BV/h的體積流量洗脫至近無色，再用70%乙醇3 BV洗脫，體積流量 (吸附及解吸附)分別選用1.5、3、5、7、9 BV/h，收集70%乙醇洗脫液，按2.1項(xiàng)下操作并進(jìn)行總皂苷的含有量測定，計(jì)算洗脫量及洗脫率。結(jié)果見表4。

表4 吸附及洗脫體積流量的考察

由表4可以看出，隨著體積流量的增加，洗脫率有明顯的降低，從79.82%逐漸降低至47.59%，因此片面增加體積流量并不能提高總皂苷的洗脫效率，應(yīng)選擇1.5 BV/h較為適宜。

2.10 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取4 g預(yù)處理過的HPD100大孔吸附樹脂，共3份，按以上工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并按2.1項(xiàng)下操作進(jìn)行總皂苷的含有量測定，計(jì)算洗脫量、洗脫率、總皂苷得率。結(jié)果見表5。

表5 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表5可知，70%乙醇流分中總皂苷的洗脫率穩(wěn)定，平均達(dá)到80.21%(n=3)，平均總皂苷得率2.11%。因此該工藝較為穩(wěn)定，洗脫率較高，可以用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3 討論

大孔樹脂在裝柱前應(yīng)當(dāng)按預(yù)處理方法處理好，否則會(huì)影響分離效果;同時(shí)還應(yīng)注意濕法裝柱時(shí)應(yīng)盡量將氣泡除去，以免柱子出現(xiàn)斷層;加入供試液時(shí)，應(yīng)緩緩加入，防止樹脂沖起，影響分離效果。由于皂苷具有很強(qiáng)的發(fā)泡性，故在濃縮過程中應(yīng)時(shí)刻注意，避免濃縮液沖出，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前采用大孔吸附樹脂技術(shù)分離、純化藥材皂苷類有效部位的研究較多［4-12］。本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過一系列工藝參數(shù)的優(yōu)化研究，首次建立起大孔吸附樹脂分離純化觀音草中總皂苷的工藝路線，其具體工藝參數(shù)為:選用HPD100型號(hào)大孔吸附樹脂裝柱，上樣吸附時(shí)間為2 h，采用70%乙醇3 BV進(jìn)行洗脫，體積流量為1.5 BV/h。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該工藝路線穩(wěn)定可行，可為觀音草的生產(chǎn)應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

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