柯仲成， 程子洋， 陳 龍

(黃山學(xué)院化學(xué)系制藥工程教研室，安徽黃山245041)

貫葉金絲桃是藤黃科植物貫葉金絲桃Hypericum perforatum.L的地上干燥部分，具有清熱利濕、舒肝解郁等功效。藥理研究表明，其含有的總黃酮成分具有抗抑郁、抗乙肝病毒作用和利膽作用［1-2］，金絲桃苷效果最好。文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)中，大多是采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)金絲桃苷提取工藝進(jìn)行考察［3-4］?？紤]正交設(shè)計(jì)的局限性，本實(shí)驗(yàn)通過 Box-Behnken效應(yīng)面法［5-8］考察貫葉金絲桃中金絲桃苷的影響因素，優(yōu)化確定提取工藝。

1 儀器和試劑

島津LC-10A高效液相色譜儀 (日本)，色譜柱Alltima C18(5 μm，4.0 mm×250 mm)，BT25S電子天平 (賽多利斯)，圓底燒瓶 (安徽玉珠玻璃儀器有限公司)。

金絲桃苷對(duì)照品 (購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)111521-200603)，貫葉金絲桃購(gòu)自黃山龍?jiān)此帢I(yè)有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院潘魯敏副教授鑒定為藤黃科植物貫葉金絲桃;乙醇購(gòu)自黃山酒精廠;其他試劑均為色譜純、分析純;重蒸餾水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 金絲桃苷測(cè)定方法的建立

2.1.1 色譜條件［9］流動(dòng)相為水-乙腈-磷酸 (825∶175∶1)，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量20 μL，Alltima C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)色譜柱柱溫為40℃。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取5.2 mg金絲桃苷對(duì)照品，用適量70%甲醇溶解，再定容于25 mL量瓶中，制成0.208 mg/mL對(duì)照品貯備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取貫葉金絲桃適量，碎成粗粉，用70%乙醇加熱回流提取，過濾，回收乙醇，加沸水溶解，冷卻，過濾，濃縮，干燥的提取物，加適量70%甲醇溶解，過濾，定容至50 mL量瓶中，制成供試品溶液。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取金絲桃苷對(duì)照品貯備液0.5、1、2、3、4 mL，分別用70%甲醇定容至10 mL，配制得一系列對(duì)照品溶液，分別測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y=172352X+10145(r=0.9984)，說明金絲桃苷在104～832 μg范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，RSD為1.58%，說明在24h內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為1.78%，說明儀器的精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批貫葉金絲桃樣品6份，按2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液測(cè)定，測(cè)得貫葉金絲桃中金絲桃苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.04 mg/g，RSD為1.49%，說明具有良好的重復(fù)性。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取貫葉金絲桃粗粉10.0 g，平行6份，加入金絲桃苷對(duì)照品溶液4 mL(金絲桃苷質(zhì)量濃度20.8 μg/mL)，用70%甲醇溶解，過濾，定容至10mL量瓶中，HPLC測(cè)定，計(jì)算得金絲桃苷平均回收率 (n=5)98.27%，RSD為1.77%。

2.1.9 樣品測(cè)定 取供試品溶液，HPLC測(cè)定，見圖1，圖2。根據(jù)其峰面積，計(jì)算金絲桃苷的提取率。

圖1 金絲桃苷對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液HPLC色譜圖

金絲桃苷提取率 (Y)=提取液中金絲桃苷量 /原藥材中金絲桃苷量×100%

2.2 貫葉金絲桃中金絲桃苷提取工藝優(yōu)化

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 通過文獻(xiàn)［3，10］和預(yù)試驗(yàn)，得出影響貫葉金絲桃回流提取的主要因素有:溶劑用量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間及提取次數(shù)等?？紤]到提取次數(shù)為非連續(xù)變量因素，回歸處理較為繁瑣，故根據(jù)實(shí)際情況，將其固定為2。依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的研究思路，將每個(gè)因素設(shè)置3水平，用代碼值-1、0、1來表示。代碼值所代表的實(shí)際值見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 考察因素與水平的編碼與實(shí)際值

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 二項(xiàng)式方程數(shù)學(xué)模型擬合 將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，利用軟件 (Design-Expert 7.1.3)進(jìn)行效應(yīng)面分析，以金絲桃苷提取率 (Y)為效應(yīng)值，對(duì)各因素 (X1、X2、X3)分別進(jìn)行二項(xiàng)式方程擬合和多元線性回歸，得回歸方程如下:

二項(xiàng)式方程擬合:Y=71.08+1.37X1+2.20X2+1.26X3－0.78X1X2+0.36X1X3－0.20X2X3－0.17－

多元線性回歸:Y=70.15+1.37X1+2.20X2+1.26X3(R2=0.8307)

比較R2大小，發(fā)現(xiàn)二項(xiàng)式方程擬合較為理想，刪除其中t檢驗(yàn)不顯著項(xiàng)，將二項(xiàng)式方程簡(jiǎn)化為:

從方差分析結(jié)果 (見表3)可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)金絲桃苷提取率都有極顯著影響;乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的相互作用具有顯著影響，含乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間、料液比和提取時(shí)間的相互作用沒有顯著影響;回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說明影響提取的其他一些未知因素對(duì)試驗(yàn)干擾比較小。因此，該方程較好地描述了金絲桃苷提取率隨各個(gè)因素的變化規(guī)律，具有良好的預(yù)測(cè)指導(dǎo)性。

表3 方差分析

2.2.3 提取工藝參數(shù)優(yōu)化和預(yù)測(cè) 依據(jù)二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Design-Expert 7.1.3軟件，繪制金絲桃苷提取率(Y)與相互作用較顯著的兩個(gè)自變量 (X1、X2)的三維效應(yīng)曲面圖 (X3=2)及等高曲線。利用回歸模型進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)金絲桃苷提取率的最大值為73.17%，最優(yōu)提取工藝條件為:11.0倍量的77.6%乙醇，提取2次，每次2.7 h。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)測(cè)得出的最優(yōu)提取工藝條件，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為了方便工業(yè)化生產(chǎn)，將提取工藝參數(shù)設(shè)為整數(shù)，為11.0倍量的78%乙醇，提取2次，每次3 h，平行3次。金絲桃苷的提取率分別為71.77%、71.94%、70.15%，平均值為71.29%，RSD為1.39%。說明所建立的數(shù)學(xué)模型具有精確的預(yù)測(cè)性，所選工藝條件具有良好的重現(xiàn)性。

3 討論

傳統(tǒng)中藥的提取工藝研究中，多采用的是正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，雖然也可以取得較好的效果，但由于其是采用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，因而經(jīng)常無法精確找到最佳點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用非線性數(shù)學(xué)模型Box-Behnken效應(yīng)面法進(jìn)行擬合，可以充分考慮了各因素之間的交互作用，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性和預(yù)測(cè)指導(dǎo)性，將更好地促進(jìn)貫葉金絲桃中金絲桃苷的開發(fā)利用。

效應(yīng)面優(yōu)化法在藥物制劑［11-13］中應(yīng)用較為廣泛，近年來，在傳統(tǒng)藥物的研究也逐漸深入，但還沒有很好地應(yīng)用于現(xiàn)代中藥行業(yè)中。本研究采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)傳統(tǒng)藥材的提取工藝進(jìn)行了考察，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，為其進(jìn)一步應(yīng)用于中藥產(chǎn)業(yè)提供科學(xué)、合理的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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