姜云云， 葉光明*， 范國榮， 陳云紅， 沐 韋， 潘小明

(1.中國人民解放軍第101醫(yī)院，江蘇無錫214044;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥物分析教研室，上海200433)

蘆筍Asparagus officinalis L.是百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物，學(xué)名石刁柏，民間又稱為文山竹、龍須菜、細百葉部、索羅羅等。研究表明，蘆筍中含有非常豐富的黃酮類成分，是一種理想的綠色保健食品，具有降血脂、抗腫瘤、增強免疫力、抗疲勞和保護肝臟等藥理活性［1-3］，這些功效與其含有的黃酮類成分關(guān)系密切［4-7］。到目前為止，鮮見有關(guān)蘆筍中黃酮類化合物抗氧化活性的研究報道。為詳細闡述蘆筍中黃酮類化合物的抗氧化活性，本實驗以維生素C為陽性對照，采用比色法測定蘆筍總黃酮和5種黃酮苷對·OH、O2－和DPPH·的清除作用以及對大鼠紅細胞氧化溶血的抑制作用，為進一步闡明蘆筍作用機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 蘆筍鮮品購于當?shù)爻?，產(chǎn)地福建，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張巧艷教授鑒定。

1.2 儀器與試劑 美國Cary50型紫外分光光度計;二苯代苦味肼基自由基 (DPPH·)購自日本東京化成工業(yè)株式會社;還原性輔酶Ⅰ (NADH)、酚嗪二甲基硫酸鹽(PMS)、四氮唑藍 (NBT)、堿性桃紅T均購自Sigma公司;其余試劑均為分析純，購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司。

槲皮素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、煙花苷和水仙苷對照品均為本實驗室自制［采用ESI-MS結(jié)合1H-NMR(DMSO)和13C-NMR(DMSO)的方法鑒定結(jié)構(gòu)，純度＞98%］。

1.3 實驗動物 SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～220 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆筍總黃酮的制備 新鮮蘆筍于60℃烘干備用，稱取干燥蘆筍400 g，加4000 mL 60%乙醇回流提取2 h，過濾，濾渣繼續(xù)用3000 mL 60%乙醇回流提取2 h，過濾，合并濾液，于60℃減壓濃縮至400 mL。

上述濃縮液經(jīng)D101型大孔吸附樹脂柱 (60 cm×4 cm)吸附1 h，再依次用水1500 mL、20%乙醇2000 mL和40%乙醇2000 mL洗脫。收集40%乙醇部分并于50℃減壓濃縮至干，所得粉末再經(jīng)Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠柱富集純化，即得蘆筍總黃酮。經(jīng)高效液相色譜法測定，其中槲皮素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、煙花苷、水仙苷的質(zhì)量分數(shù)分別為12.62%、23.28%、5.09%、4.89%、3.22%。

2.2 總黃酮及黃酮苷單體對·OH生成的影響［8］·OH可特異性地使堿性桃紅T褪色，根據(jù)褪色的幅度可以測定·OH的生成量。實驗步驟如下:于5 mL量瓶中依次加入堿性桃紅 T(70 μg/mL)1 mL，3%H2O21 mL，2 mmol/L EDTANa2-Fe(Ⅱ)2 mL，混勻后加入不同體積的樣品溶液，最后加0.15 mmol/L的pH 7.4的磷酸緩沖液至刻度?；靹蚝笥?7℃水浴放置30 min，對照組以水代替樣品溶液，空白組以水代替樣品及EDTANa2-Fe(Ⅱ)，以維生素C為陽性對照于520 nm比色測定，按照公式抑制率(%)= ［(A樣品－A空白)/(A對照－A空白)］ ×100%計算抑制率，根據(jù)抑制率和樣品濃度的擬合方程求得IC50值，結(jié)果見表1。陽性對照維生素C的IC50值為5.33 μg/mL。

表1 總黃酮及黃酮苷單體對·OH的抑制率(n=3)

2.3總黃酮及黃酮苷單體對O－2生成的影響［8］取適量NADH、PMS和NBT于同一量瓶中，加16 mmol/L，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液溶解，使NADH、PMS和NBT的濃度分別為73 μmol/L，15 μmol/L和50 μmol/L，O－2即由該NADH-PMS-NBT系統(tǒng)產(chǎn)生。取該混合溶液2.0 mL，分別加入系列濃度樣品溶液1.0 mL，混勻后于560 nm比色測定。空白管不加PMS，對照管以水代替樣品，按照公式抑制率(%)= ［(A空白－A樣品)/A對照］ ×100%計算抑制率，根據(jù)抑制率和樣品濃度的擬合方程求得IC50值，結(jié)果見表2。陽性對照維生素C的IC50值為3.80 μg/mL。

表2 總黃酮及黃酮苷單體對O－2的抑制率(n=3)

2.4 總黃酮及黃酮苷單體對DPPH自由基的清除作用 配制濃度為2×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存，備用。將樣品配成系列濃度的乙醇溶液，吸取各濃度溶液1.0 mL于具塞離心管中，分別加入2×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液4.0 mL，搖勻后室溫放置30 min，以乙醇為對照，在517 nm處測定吸光度Ai。另取上述系列濃度的樣品液各1.0 mL，分別加入4.0 mL乙醇，混合后在517 nm處測定吸光度Aj。再取1.0 mL乙醇，加入4.0 mL DPPH乙醇溶液，混合后在517 nm處測定吸光度 Ac，用公式清除率(%)=［1－ (Ai－Aj)/Ac］ ×100%計算清除率，根據(jù)清除率和樣品濃度的擬合方程求得IC50值，結(jié)果見表3。陽性對照維生素C的IC50值為3.09 μg/mL。

2.5 總黃酮及黃酮苷單體對大鼠紅細胞氧化溶血的影響［9］SD大鼠眼眶取血，1000 g離心10 min，分離得到紅細胞，生理鹽水洗滌3次制成0.5%懸液，取該紅細胞懸液1.0 mL，加不同濃度的樣品液200 μL，再加100 mmol/L H2O2溶液200 μL混勻。置37℃水浴中保溫1 h，用生理鹽水稀釋10倍，1000 g離心10 min后取上清液于415 nm處比色測定，模型組不加樣品，空白組不加H2O2溶液，按公式抑制率(%)= ［1－ (A樣品－A空白)/(A模型－A空白)］ ×100% 計算抑制率，根據(jù)抑制率和樣品濃度的擬合方程求得IC50值，結(jié)果見表4。陽性對照維生素C的IC50值為10.55 μg/mL。

表3 總黃酮及黃酮苷單體對DPPH自由基的清除率 (n=3)

表4 總黃酮及黃酮苷單體對大鼠紅細胞氧化溶血的抑制率 (n=3)

3 討論

蘆筍中分離得到的5種黃酮苷單體均有較強的體外清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基及抑制紅細胞氧化溶血的活性。蘆筍總黃酮也表現(xiàn)出一定的體外抗氧化活性，但與5種黃酮苷相比，其IC50要高很多，這與蘆筍總黃酮中黃酮質(zhì)量分數(shù) (50%～60%)有關(guān)，另外，蘆筍黃酮部位中含有的非黃酮類成分可能不具備抗氧化活性甚至具有拮抗效應(yīng)。

黃酮類主要是通過酚羥基與自由基反應(yīng)，形成共振穩(wěn)定的半醌式自由基而中斷鏈式反應(yīng)的，因此，共振半醌式自由基的穩(wěn)定性與抗氧化劑活性成正相關(guān)。從本實驗中5種黃酮苷對·OH的IC50結(jié)果來看，抗氧化活性從強到弱依次為蘆丁、槲皮素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖-蕓香糖苷、煙花苷，這與文獻上有關(guān)黃酮類化合物抗氧化活性構(gòu)效關(guān)系的分析是基本一致的［10-11］。黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)中，B環(huán)是抗氧化、清除自由基的主要活性部位，且活性強弱與B環(huán)上羥基數(shù)目直接相關(guān)，隨B環(huán)上羥基數(shù)目的增加而增加。當B環(huán)酚羥基數(shù)目相同時，含鄰二酚羥基的黃酮抗氧化活性明顯優(yōu)于B環(huán)含間二酚羥基的黃酮。A環(huán)的5，7位酚羥基是高效黃酮類抗氧化劑所必備的，這兩處的酚羥基易與過渡金屬絡(luò)合，但7位羥基有較強的酸性，這些都有利于抗氧化活性的提高。C環(huán)上的羥基的抗氧化活性則取決于不同的氧化體系。

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