李 晶， 于海波， 于海濤， 王淑秋， 王偉群， 賈琳琳

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154002;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯154002)

癲癇發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，大量研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮(NO)與一氧化氮合酶 (NOS)參與了癲癇的點燃［1］，而腦損傷的另一途徑是持續(xù)存在的細胞凋亡。研究癲癇的靶區(qū)通常選擇顳葉皮質(zhì)和海馬區(qū)［2］，因其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)對癲癇最敏感的腦區(qū)。本研究觀察靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠腦組織Caspase-3、NO、NOS水平的影響，探討其作用機理，為靈芝孢子粉中藥資源的深入開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 雄性Wistar大鼠 (10周齡，佳木斯大學(xué)實驗動物中心，黑動字第99102001號);戊四氮 (PTZ，美國Sigma公司，10 g/L溶液雙蒸水配制);靈芝孢子粉(佳木斯市野生靈芝種植基地，30 g/L溶液雙蒸水配制);SABC試劑盒、PBS及枸櫞酸鈉緩沖液、多聚賴氨酸、Caspase-3多克隆抗體 (武漢博士德公司);JA型電子精密天平 (上海衡平科學(xué)儀器有限公司);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司);BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) (成都泰盟生物科技公司);NO、NOS試劑盒 (南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗方法 30只雄性Wistar大鼠，隨機分成3組，每組10只，分別是正常組 (生理鹽水腹腔注射+生理鹽水灌胃);模型組 (戊四氮腹腔注射+生理鹽水灌胃);用藥組(戊四氮腹腔注射+靈芝孢子粉灌胃)。32 mg/kg為戊四氮腹腔注射劑量 (亞驚厥劑量)，150 mg/kg為靈芝孢子粉灌胃劑量。每天上午11點進行，1次/d(灌胃前禁食6 h，持續(xù)28 d)。

1.3 癲癇發(fā)作行為學(xué)觀察 癲癇發(fā)作評分標準:0級，無反應(yīng);Ⅰ級，點頭/甩尾;Ⅱ級，須動/頭面抽動;Ⅲ級，前肢/后肢抽動;Ⅳ級，全身抽動;Ⅴ級，竄動;Ⅵ級，全面性強直-陣攣發(fā)作。癲癇造模成功為連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥發(fā)作［3］。

1.4 檢測指標 模型建成后 (在每次注射戊四氮后觀察大鼠行為表現(xiàn)，且注射劑量及時間28 d內(nèi)保持恒定)，乙醚吸入麻醉 (注意劑量)，斷頭取腦組織 (分離出皮質(zhì)、海馬)，10%甲醛固定24h，常規(guī)石蠟包埋。取一半皮質(zhì)、海馬做6 μm切片，行SABC法Caspase-3免疫組化染色。另一半皮質(zhì)、海馬稱質(zhì)量后配成10%勻漿液 (加生理鹽水)，4000 r/min離心，時間15 min，取上清液檢測NO、NOS水平，操作按照試劑盒說明。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 SPSS軟件分析所有數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差 (±s)表示，差別有統(tǒng)計學(xué)意義為P＜0.05，組間比較先用方差分析，再用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 動物模型行為表現(xiàn) 正常組無任何行為異常，模型組、用藥組有連續(xù)多次的Ⅲ～Ⅴ級癲癇發(fā)作 (注射戊四氮后3 min左右出現(xiàn)，達到高峰一般需要7 min，通常20 min后很少再有抽搐發(fā)作)，組間差異無顯著性，見表1。

表1 各組大鼠抽搐強度的比較 (±s，n=10)

表1 各組大鼠抽搐強度的比較 (±s，n=10)

注:與正常組比較，*P＜0.05;與用藥組比較，#P＞0.05。

分組 Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅲ級 Ⅳ級 Ⅴ級 Ⅵ級0 0 0 0 0 0模型組 － － 4* 2# 2 2用藥組 1 3*正常組5 1 0 0

2.2 對癲癇腦組織Caspase-3、NO、NOS的影響 模型組皮質(zhì)、海馬Caspase-3表達增加，海馬相對皮質(zhì)增加更顯著。Caspase-3表達主要在胞漿，少部分在胞核 (棕黃色顆粒是陽性細胞，其計算采取隨機原則)。皮質(zhì)各層彌散分布，海馬分布在錐體細胞層及顆粒細胞層。

腦組織 NO、NOS水平，正常組低于用藥組 (P＜0.05);用藥組低于模型組 (P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)Caspase-3陽性細胞數(shù)及NO水平、NOS活性變化 (±s，n=10)

表2 各組大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)Caspase-3陽性細胞數(shù)及NO水平、NOS活性變化 (±s，n=10)

注:與正常組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

分組顳葉皮質(zhì)Caspase-3 NO/(μmol·L－1) NOS/(U·g－1) Caspase-3 NO/(μmol·L－1) NOS/(U·g－1海馬)正常組 82.40±2.89 4.15±0.49 0.24±0.03 51.30±2.83 4.56±1.31 0.23±0.07模型組 149.70±5.12* 12.54±3.09* 0.67±0.12* 111.10±5.45* 11.49±2.63* 0.58±0.10*用藥組 122.90±4.51# 6.45±1.61# 0.28±0.09# 78.30±5.42# 6.86±2.27# 0.29±0.05#

3 討論

戊四氮所致癲癇與人類自發(fā)性癲癇極為相似，可在某種程度上反映人類癲癇的不同特征［4］。且其本身沒有神經(jīng)毒性，不破壞腦組織，是制備癲癇模型常用化學(xué)制劑［5］。

研究發(fā)現(xiàn)，氣體神經(jīng)遞質(zhì)NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可逆信使，其生物合成調(diào)節(jié)最關(guān)鍵的因素是NOS［6］。本研究顯示，模型組NO水平、NOS活性增高，說明NO、NOS參與癲癇發(fā)作。靈芝孢子粉可降低NO、NOS的水平及活性，減輕NO、NOS對腦組織 (皮質(zhì)及海馬)損害，具有顯著的抗癇作用。

在細胞凋亡的分子機制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位的是可使凋亡細胞解體的Caspase家族 (也稱死亡蛋白酶、關(guān)鍵蛋白酶)。caspase-3激活參與癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元凋亡［7］。作用于其他的caspase家族成員，凋亡細胞中的某些成分被降解，放大蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，使細胞最終走向凋亡［8］。本研究中模型組Caspase-3表達水平 (皮質(zhì)及海馬)增加，尤以海馬增加更明顯 (可能海馬較皮質(zhì)更為敏感)。

本研究結(jié)果顯示，靈芝孢子粉能減少Caspase-3的表達，降低腦組織中 NO、NOS水平?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)Caspase-3、NO、NOS水平、改善神經(jīng)電生理功能 (皮質(zhì)及海馬)，降低神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，減輕神經(jīng)細胞的凋亡，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)保護神經(jīng)元［9］。充分顯示了中醫(yī)中藥對癲癇治療研究的潛在優(yōu)勢和廣闊前景。

［1］李春香，于 明，唐寧波，等.戊四唑致癲癇大鼠腦組織NO和MDA含量及其相關(guān)性研究［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2002，15(2):100-101.

［2］謝 煒，于云紅，趙云燕，等.同病異治復(fù)方對戊四氮慢性點燃大鼠癇性發(fā)作的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2010，37(10):1898-1900.

［3］張麗萍，王進聲，陳 青，等.戊四唑致癇模型大鼠腦神經(jīng)元損害及寧癇顆粒的干預(yù)作用［J］.山東中醫(yī)雜志，2004，23(10):619-620.

［4］Qu H，Eloqayli H，Sonnewald U.Pentylenetetrazole affects metabolism of astrocytes in culture［J］.J Neurosci Res，2005，79(1-2):48-54.

［5］Erdogan F，Golgeli A，Arman F，et al.The effects of pentylenetetrazole-induced status epilepticus on behavior，emotional memory，and learning in rats［J］.Epilepsy Behav，2004，5(3):388-393.

［6］陳燕惠.一氧化氮在癲癇和學(xué)習(xí)中的作用［J］.國外醫(yī)學(xué)生理病理科學(xué)與臨床分冊，2000，20(1):76-78.

［7］Henshall D C，Chen J，Simon R P.Involvement of caspase-3-like protease in the mechanism of cell death following focally evoked limbic seizures［J］.J Neurochem，2000，74(3):1215-1223.

［8］趙 爽，康玉明，張勝昌.靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦IGF-1、NF-κB表達及神經(jīng)細胞凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2007，12(6):1153-1156.

［9］趙 爽，張勝昌，王淑秋.靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦NF-κB免疫反應(yīng)性影響及行為學(xué)觀測［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，12(6):240.