王 芳， 計巧靈， 鄧 倩， 李玉薇

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046)

羅布麻Apocynum venetum Linn隸屬夾竹桃科Apocynaceae羅布麻屬，是一種多年生草本植物，又名野麻、紅麻、茶葉花，我國主要分布在新疆、青海、甘肅、陜西、河南等省區(qū)［1］。羅布麻全草入藥已千年，分別被載入2005、2010年版的《中國藥典》之中［2-3］。羅布麻葉含有黃酮類化合物、生物堿、酚類、強心苷、氨基酸和微量元素［4-5］，其中黃酮類化合物在羅布麻的藥用成分中占很大比例［6］，主要包括蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素等［7-8］，據(jù)報道，金絲桃苷、異槲皮苷在鎮(zhèn)痛、保護心肌、保肝、抗氧化方面有重要作用［9-12］。然而，由于羅布麻生境、氣候環(huán)境等條件不斷惡化，致使資源越來越匱乏，不宜大規(guī)模開發(fā)利用，限制了羅布麻這一重要資源的開發(fā)。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，研究以羅布麻愈傷組織為材，生產(chǎn)金絲桃苷、異槲皮苷等重要的次生代謝藥效成分具有重要的現(xiàn)實意義。目前，關(guān)于運用羅布麻組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分的研究，除了本實驗室以羅布麻愈傷組織為材產(chǎn)綠原酸［13］外，在國內(nèi)外未見其他報道。本實驗探討了培養(yǎng)條件對羅布麻愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷積累的影響，以期為提高羅布麻愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷的含有量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器與試劑 LC-10A高效液相色譜儀 (日本島津公司)(LC-10ATVP泵，SPD-10AVP紫外檢測器，CTO-10AVP柱溫箱，2010化學(xué)工作站);0.22 μm微孔纖維素濾膜;KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器;SORVALL Pico and Fresco微型離心機;電子天平 (型號 AL104，METTLER TOLEDO);PYX-DHS-40X50-B型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海躍進醫(yī)療器械廠);實驗室常規(guī)儀器設(shè)備。金絲桃苷對照品 (批號:20110311)，異槲皮苷對照品(批號:20110619)均購于上海源葉生物科技有限公司;甲醇 (色譜純);乙腈 (色譜純);磷酸(優(yōu)級純);超純水。

1.2 材料 羅布麻種子采自新疆精河縣，羅布麻子葉來源的愈傷組織由本實驗室提供，愈傷組織培養(yǎng)溫度為 (25±2)℃，光照周期為16 h/d，光強度為2500 lx。愈傷組織分別培養(yǎng)在不同條件的培養(yǎng)基，收集的愈傷組織在培養(yǎng)箱中30℃干燥至恒定質(zhì)量，粉碎過40目篩，得粗粉備用。

1.3 色譜條件 C18-ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm);柱溫25℃;檢測波長360 nm;體積流量0.6 mL/min;進樣量20 μL;流動相見表1。

表1 梯度洗脫流動相Tab.1 Mobile-phase of gradient elution

1.4 愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的測定

1.4.1 愈傷組織生長率的測定 每個處理接種3瓶，每瓶接種愈傷組織5塊 (約0.5 g)，愈傷組織生長25 d后，取出每瓶中的愈傷組織稱定質(zhì)量。愈傷組織生長率=(收獲時的愈傷組織濕重-接種時的愈傷組織濕重)/接種量，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 金絲桃苷和異槲皮苷的測定 精確稱取粗粉0.10 g，準確加入80% 甲醇1.0 mL，于40℃，60 W，超聲提取40 min，12000 r/min離心5 min，取上清，過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。按上述色譜條件測定金絲桃苷和異槲皮苷。

1.5 對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷對照品各20 mg，分別加80%甲醇100 mL溶解，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。

1.6 線性關(guān)系考察 分別取上述金絲桃苷、異槲皮苷對照品溶液 0.5、2.5、5、7.5、10 mL，用80%甲醇定容至10 mL，按照上述色譜條件取20 μL進樣進行測定，以峰面積與質(zhì)量濃度 (x)繪制工作曲線，得金絲桃苷回歸方程為y=752.76x－2.6927，R2=0.9996;異槲皮苷回歸方程為y=728.32x－2.58297，R2=0.9998，結(jié)果在0.01～0.20 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.7 羅布麻葉中金絲桃苷和異槲皮苷

1.7.1 精密度試驗 分別精密吸取上述兩種對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣5次，測定峰面積，計算，得金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為1.4%、1.2%，表明精密度良好。

1.7.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品，分別于0、1、2、4、8、12、14、16 h進樣，測定峰面積，計算，得金絲桃苷、異槲皮苷峰面積的RSD分別為1.0%、0.9%，表明樣品在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.7.3 重復(fù)性試驗 取同一個供試品共5份，按1.4.2項制備，測定，金絲桃苷、異槲皮苷的峰面積的平均值分別為4091366.2、6163213.1，RSD分別為1.1%、1.3%，表明重復(fù)性良好。

1.7.4 加樣回收試驗 取同一個樣品共12份，其中6份用于測定本底值，另外6份中分別添加一定量的金絲桃苷和異槲皮苷對照品，進行測定，結(jié)果金絲桃苷平均回收率98.34%，RSD為1.6%;異槲皮苷平均回收率97.58%，RSD為1.3%，說明該方法適合分析羅布麻愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷。

1.7.5 樣品測定 精確稱取羅布麻葉粉0.1 g，按1.4.2項提取，經(jīng)HPLC檢測，8月份野生羅布麻葉中金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量分數(shù)分別為6.02 mg/g、7.14 mg/g。

1.8 實驗設(shè)計

1.8.1 測定8月份野生羅布麻葉片中金絲桃苷和異槲皮苷，操作同1.7.5項。

1.8.2 將多份相近質(zhì)量的愈傷組織分別接種在含不同激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討愈傷組織產(chǎn)金絲桃苷、異槲皮苷的最佳激素配比 (見表2)。

表2 培養(yǎng)基不同激素配比對愈傷組織產(chǎn)金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.2 Effects of media with the different matching of hormone on hyperinand and isoquercitrin contents in callus of Apocynum venetum L.*

1.8.3 將稱定質(zhì)量的多份愈傷組織分別接種在含不同蔗糖、葡萄糖濃度的最佳激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討碳源對愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 (見表3)。

1.8.4 將稱定質(zhì)量的多份愈傷組織分別接種在含不同濃度的NH4NO3和KNO3、而含最佳碳源、激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討氮源對愈傷組 織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 (見表4)。

表3 碳源對愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.3 Effects of carbon source on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

表4 氮源對愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.4 Effects of nitrogen source on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

1.8.5 將稱重的多份愈傷組織分別接種在添加不同濃度NaCl而含最佳氮源、碳源、激素配比的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25 d，探討NaCl濃度對愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 (見表5)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比的培養(yǎng)基對羅布麻愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷積累的影響 由表2可見，當(dāng)培養(yǎng)基附加0.5 mg/L KT和0.5 mg/L NAA時，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量均最高，分別達到6.12 mg/g和7.23 mg/g;在4種激素組合中，KT和NAA組合最有利于愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷的積累;適量濃度的KT與NAA，6-BA與NAA組合較有利于愈傷組織生長。

2.2 培養(yǎng)基碳源對羅布麻愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 由表3可知，培養(yǎng)基的碳源為20g/L蔗糖+20g/L葡糖糖時，愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷含有量均達最高，分別為14.89倍和7.45 mg/g、8.69 mg/g;培養(yǎng)基以蔗糖為碳源較有利于愈傷組織的生長;培養(yǎng)基不同碳源對愈傷組織的生長率和金絲桃苷、異槲皮苷積累有較大影響。

表5 不同濃度NaCl對愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響Tab.5 Effects of different NaCl concentrations on hyperin，isoquercitrin contents and callus growth rate

2.3 培養(yǎng)基氮源對羅布麻愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 由表4可知，當(dāng)培養(yǎng)基含1650 mg/L NH4NO3+1900 mg/L KNO3時愈傷組織生長率最大，為13.74倍，金絲桃苷和異槲皮苷含有量分別達到7.71 mg/g和8.99 mg/g;當(dāng)培養(yǎng)基中含2475 mg/L NH4NO3+2850 mg/L KNO3或3300 mg/L NH4NO3+3800 mg/L KNO3時，愈傷組織褐化嚴重，部分死亡;當(dāng)培養(yǎng)基含2475 mg/L NH4NO3時，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量均達最大值，分別為8.67 mg/g、9.86 mg/g，生長率為7.95倍，可見氮源對愈傷組織的生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的積累有較大影響。

2.4 不同濃度NaCl對羅布麻愈傷組織生長率和金絲桃苷、異槲皮苷的影響 由表5可知，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為25 mmol/L時，愈傷組織生長率最大，為13.36倍;隨著NaCl濃度增加，生長率逐漸減小，當(dāng)NaCl濃度為500 mmol/L時，愈傷組織嚴重褐化，部分死亡。當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為150 mmol/L時，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量最高，分別為10.07 mg/g、11.15 mg/g;當(dāng)NaCl濃度為300 mmol/L時，這兩種成分的含有量分別為8.09 mg/g、9.17 mg/g，可見，適量濃度NaCl能促進愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷的積累。

3 討論

本實驗培養(yǎng)基中添加不同激素配比對細胞中次生代謝產(chǎn)物的積累有一定影響，這與文獻［14-15］報道的一致，培養(yǎng)基中添加不同配比的激素，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量不同，附加0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA時，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量最高，說明植物生長調(diào)節(jié)劑是影響植物次生代謝物質(zhì)積累的一個因素。

糖是培養(yǎng)基必需的碳源，既提供能量，也對維持滲透壓起重要作用，通過探究不同碳源對愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含有量的影響，發(fā)現(xiàn)碳源為2.0 mg/L蔗糖+2.0 mg/L葡糖糖時，愈傷組織的生長率和金絲桃苷、異槲皮苷含有量均達最高，但碳源為5.0 mg/L時，愈傷組織生長和次生代謝物積累均受到抑制，可能是糖濃度過高，致使培養(yǎng)基滲透壓提高，不利于細胞被動吸收營養(yǎng)，進而影響愈傷組織生長和次生代謝物積累。

氮源也是培養(yǎng)基中不可缺少的養(yǎng)分，氮元素含有量的減少往往刺激次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量增加［16］，本實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中氮源單獨使用NH4NO3或KNO3時，濃度過高、過低均不利于愈傷組織中金絲桃苷和異槲皮苷的積累;同時使用兩種氮源時，較單獨使用利于金絲桃苷和異槲皮苷的積累，但是濃度過高會使細胞褐化死亡;培養(yǎng)基添加常規(guī)MS培養(yǎng)基氮源時，愈傷組織生長率最大;若僅考慮金絲桃苷和異槲皮苷的含有量，2475 mg/L NH4NO3為最佳氮源。

實驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中NaCl濃度為25 mmol/L時，愈傷組織生長率最大，培養(yǎng)基中NaCl濃度為150 mmol/L時，愈傷組織中金絲桃苷、異槲皮苷含量最高，但是當(dāng)NaCl為500 mmol/L時，愈傷組織褐化死亡;說明NaCl對愈傷組織中次生代謝產(chǎn)物的積累起一定的作用，可能是因為羅布麻是一種耐鹽植物，其細胞對一定濃度的鹽離子有耐受性。有關(guān)培養(yǎng)基中NaCl對植物次生代謝產(chǎn)物積累的影響尚未見報道。

［1］ 中國植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京:科學(xué)技術(shù)出版社，1977:63，157-165.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2005年版一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:147.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:196-197.

［4］ 曾海松.羅布麻葉的化學(xué)成分研究［D］.西安:西北大學(xué)，2009.

［5］Kazuaki K，Shujiro S，Junichiro N.Constituents from leaves of Apocynum venetum［J］.J Nat Med，2008，62:160-163.

［6］Yokozaw T，Kashiwada Y.Study on the component of luobuma with peroxynitrite scavenging activity［J］.Biol Pharm Bull，2002，25(6):748-752.

［7］李麗紅，原中.羅布麻葉黃酮類成分的研究［J］.中國中藥雜志，2006，31(6):1337-1340.

［8］程秀麗，張素瓊，李青山.羅布麻葉中黃酮類化合物研究［J］.中藥材，2007，30(9):1086-1088.

［9］Ponticeli F，Trendafilora A，Valoti M，et al.Synthesis and antiperoxidant activity of new phenolic o-glycosides［J］.Carbohydr Res，2001，330:459-468.

［10］Sandei N，Michiko M，Chisako C，et al.Flavonoid content in A-pocynum and Poacynum leaves and lipidperoidation inhibiting efect offlavonoids［J］.Nat Med，1994，48(4):322.

［11］Takako S.Purgative activity and principal of the fruit of Rosa multiflora and R.wichuraiana［J］.Chem Pharm Bull，1992，40(8):2080-2082.

［12］陳志武，章家勝，馬傳庚.金絲桃苷對大鼠腦梗塞的保護作用［J］.中國中藥雜志，1998，23(10):626-628.

［13］金 越，呂 勇，韓國柱，等.槲皮素及異槲皮素、蘆丁抗自由基活性的比較研究［J］.中草藥，2007，38(3):408-412.

［14］劉小銳，朱國麗，賈紅麗，等.羅布麻愈傷組織中綠原酸的提取和測定［J］.藥物分析雜志，2009，29(12):2116-2119.

［15］Wang Junli，Liao Xiangru，Zhang Hongmei，et al.Accumulation of chlorogenic acid in cell suspension cultures of Eucommia ulmoides［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，74(2):193–195.

［16］Jayakumaran Nair A，Sudhakaran P R，Madhusudana Ra J，et al.Berberine synthesis by callus and cell suspension cultures of Coscinium fenestratum［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1992，29(1):7-10.

［17］賈景明，吳春福，吳立軍，等.天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物形成的研究［J］.中藥研究與信息，2005，7(7):11-15.